生化工程7-发酵工艺.ppt

补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,补料分批培养的优缺点,优点:在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点：由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。,优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点：损失了菌体和营养成分，提取的总体积增大，,连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持平衡生长状态和稳定的生长速率。达到稳态后，菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,常用的连续培养方法有：恒浊法恒化法可以在一定程度上，人为控制生长曲线中的某个时期，使之缩短或延长时间，使某个时期的细胞加速或降低代谢速率，大大提高培养过程的人为可控性和效率,恒浊法 是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。用于恒浊培养的培养装置称为恒浊器,用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的。恒浊法特别适合于哪些类型的发酵生产？,恒化法是通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。用于恒化培养的装置称为恒化器。恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段。,恒浊器与恒化器的比较,多级连续发酵：将多个反应器串联起来，前一个反应器的出料作为下一个反应器的进料，即为多级连续发酵。利于使用不同的发酵条件和生成不同的产物。,反馈发酵：将连续发酵放出的培养液中的菌体经浓缩回收后，返回至原发酵罐内。利于节约菌体。在这种发酵中，菌浓越来越大，代谢产物维持较低水平。,连续发酵的优点：在发酵达到稳定后，其非生产时间大大减少，设备利用效率高，生产能力大，产品质量较稳定，工艺易于实现自动化，节约了大量人力物力水蒸气等。缺点：染杂菌和菌种退化，营养物利用率低于单批培养。,连续培养是不是能一直生产下去？,发酵工艺控制,发酵控制的目的,最大的生产速率和最大的生产量，最大限度的开发菌株的生产潜能。,发酵过程的一些主要影响因素,pH值（酸碱度）温度（）溶解氧浓度基质含量空气流量压力搅拌转速搅拌功率粘度,浊度料液流量产物浓度氧化还原电位废气中的氧含量废气中的CO2含量菌丝形态菌体浓度,菌种本身的复杂性发酵过程的复杂性要从整体上去认识微生物生长与产物形成之间的关系，包括菌体的增长，成熟，生物量的积累，环境对微生物代谢方向的影响等,培养基的影响,基质浓度对培养基物理性质的影响基质对菌体生长的影响 代谢物分解阻遏 多重底物的菌体生长,温度的影响,不同的微生物有不同的适宜生长温度,大多数的工业发酵微生物是中温菌，如霉菌、放线菌和一般细菌。它们的最适生长温度一般在2040。菌体生长的最高温度，最低生长温度，最适宜生长温度。在一定温度区间内，温度升高，菌体生长加快。,温度对发酵的影响,对酶活的影响对代谢产物合成方向的影响对培养基性质的影响生长期与产物合成期的最适宜温度有可能是不同的,青霉素生成速率对温度的影响敏感，微小的温度变化，就会引起生成速率产生明显的改变，偏离最适温度就会引起产物产量发生比较明显的下降，说明了次级代谢发酵温度控制的重要性。,温度能改变菌体代谢产物的合成方向：如利用金霉素链霉菌NRRLB-1287进行四环素发酵过程中，发酵温度愈高，愈有利于四环素的合成。而30以下时合成的金霉素增多，在35时就只产四环素，而金霉素合成几乎停止。黄曲霉产生的多组分黄曲霉毒素，在20、25和30下发酵所产生的黄曲霉毒素G1与B1的比例分别为3:1、1:2、1:1。赭曲霉在1020发酵时，有利于合成青霉素，在28时则有利于合成赭曲霉毒素A。,影响发酵温度的因素,生物热：微生物生长繁殖过程中的产热搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量显 热：空气流动过程夹带着的热量Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发 Q通气-Q辐射,生物热(Q生物)产生菌在生长繁殖过程中产生的热能，叫做生物热。营养基质被菌体分解代谢产生大量的能量，部分用于合成ATP，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成了生物热。生物热的大小，是随菌种和培养基成分不同而变化。一般来说，对某一菌株而言，在同一条件下，培养基成分愈丰富，营养成分被利用的速度愈快，产生的生物热就愈大。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。,培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染杂菌。,最适温度选择,首先要考虑不同的菌种的适宜温度接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温度，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖；待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些；到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。温度的选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。,最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度，如：青霉素温度控制,温度控制要与其他因素综合考虑，在不同条件下灵活选择适合的温度,温度的控制,工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，而需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇行管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵,pH值对发酵的影响及其控制,pH对微生物发酵具有十分重要的影响pH的影响一方面来自培养环境，另一方面微生物本身对自身周围的pH有一定调节能力，并且其代谢过程也会改变体系的酸碱度。pH是发酵调控的重要参考因素pH的影响主要包括：,影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收；pH值不同对代谢方向的影响，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。,例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。,发酵过程的pH变化,1、生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵离子，使pH上升；而糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。2、生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。3、自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。,pH变化的主要原因,（1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,（4）产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,（5）菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,最适pH的选择和调节,最适pH的选择和调节的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度的获得高产。根据不同微生物的特性，在发酵过程中随时检查pH值的变化，选用适当的方法进行调节。,生长最适pH和产物形成最适pH的相互关系：两者相同，范围都宽；容易控制。两者相同，范围都窄；必须严格控制。两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。两者不同，范围都窄；分别严格控制。,调节pH值的方法：首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使用适当的缓冲剂，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制；补充生理酸性物质（如(NH4)2SO4）和生理碱性物质（如NaNO3）来控制。,目前，已比较成功地采用补料的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素(NH2)2CO，次级代谢产物抗生素发酵。这种方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。,溶解氧对发酵的影响与控制,厌氧发酵与好氧发酵 需氧微生物只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用，从而使菌体生长繁殖和积累所需要的代谢产物。底物氧化需要大量的氧。,发酵过程溶解氧的变化,根据菌种和产物的不同，不同的发酵有自己的规律。在发酵前期，菌大量繁殖，需氧量增大，溶氧明显下降，出现一个底谷，抗生素的溶氧底谷一般出现在1070h，而摄氧量达到高峰。过了生长阶段，耗氧量减缓，溶氧量保持平稳或开始上升。,到了生产后期，菌体开始衰老自溶，这时溶氧量会明显上升。溶氧的变化，还与培养方式（连续or分批），补料的方式和种类，如补糖，会引起溶氧下降。,在菌体生长期，供氧必须满足菌体呼吸的需氧量，若菌体的需氧量得不到满足，则菌体呼吸受到抑制，从而抑制菌体生长，菌体收率降低。但是供氧并非越大越好，当供氧满足菌体需要，菌体的生长速率达最大值，如果再提高供氧，不但不能促进菌体生长，造成能源浪费，而且高氧水平会抑制菌体生长,以谷氨酸为例 在长菌阶段，若供氧过量，在营养限量的情况下，菌体生长受到抑制，表现为耗糖慢，pH偏高，不易下降。在发酵阶段，若供氧不足，主要产物由谷氨酸变为乳酸，这是因为中间产物的氧化反应停滞造成的。表现为耗糖快，pH偏低，长菌而不产谷氨酸，但如供氧过量，又会导致酮戊二酸的积累。,好氧微生物的氧化酶体系是存在细胞内原生质中，因此微生物只能利用溶解于液体中的氧。随着高浓度发酵，丰富培养基的采用，对于通气和搅拌的要求更高。,溶解氧很有限而微生物的耗氧速度十分迅速，溶解氧浓度已成为需氧发酵工业中提高生产能力的限制因素。只能利用溶解氧溶解度小消耗快须使溶氧速度耗氧速度,氧是制约发酵进行的重要因素氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少；【纯氧溶纯水，1.26mmol/L；空气氧溶纯水，0.25；培养基更低】高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短加剧了对氧的需求；形成产物的最佳氧浓度和菌体生长的最佳氧浓度有可能是不同的；,发酵罐中氧的吸收率很低；（通常 1%）加大通气量会引起过多泡沫；消泡剂不利于氧的溶解。,溶氧浓度控制,发酵液的溶氧浓度，是由供氧和耗氧两方面所决定的。也就是说，当发酵的供氧量大于需氧量，溶氧就上升，直到饱和；反之就下降。因此要控制好发酵液中的溶氧，需从这两方面着手。,呼吸强度QO2与摄氧率,1.摄氧率（）单位体积培养液每小时消耗氧的量,单位为mmol(O2)/(Lh)。2.呼吸强度（QO2）单位重量的菌体每小时消耗氧的量，单位为mmol(O2)/g(干菌体)h。摄氧率与呼吸强度之间的关系：QO2X其中，X：发酵液中菌丝体浓度，g（干菌体）/L,呼吸临界氧浓度（C）,在溶氧浓度低时，呼吸强度随溶解氧浓度增加而增加，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增强而变化，此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓度，以C表示。,临界氧浓度和最适合氧浓度并不一定一致，对于临界浓度和最适浓度的了解，有助于提高供氧效率，目前发酵中对于氧的利用效率很低，大部分经过净化灭菌的空气都是浪费掉了的。,溶解氧传递的主要途径 气相 液相 细胞一般认为：在上述气液传质过程中，气液界面和液相主体的传质阻力都较小。主要的阻力来自气膜和液膜。,氧传递方程,OTR=KL(C*CL)OTR:单位体积培养液的氧传递速率KL：单位体积传质系数C*：溶液中溶氧饱和浓度，mmol O2/LCL：溶液主流中的溶氧浓度，mmol O2/L,OTR=KL(C*CL)由氧传递公式可见，凡是能使KLa和C*增加的因素都能使供氧得到提升。,提升的C*的方法：,通入纯氧或富氧，使氧分压提高（成本上升，效率较低）提高罐压（菌和和设备的承受能力，CO2的影响）提高通气速率（大气泡造成空转，泡沫问题）,氧的传质系数KLa,需氧微生物反应器的氧传递性能可用体积传质系数表示，其值越大，说明反应器的氧传递性能越好。因此，提高反应器的氧传递速率，需要增大kLa。,影响KL的因素（1）操作条件与变量 温度，通气量与搅拌强度等（2）发酵液性质 粘度、表面张力、离子浓度、密度、扩散系数等，从而影响到气泡的大小、气泡的稳定性，进而影响氧传递系数KL,影响体积传质系数KLa的主要因素,温度对Kla的影响,温度的升高，会降低液体的粘度，减小液体的表面张力，增大氧在液相中的扩散系数体积传质系数与温度成正比，而与液体粘度成反比。但同时，温度升高，会导致氧溶解度下降。,盐类对Kla的影响体系中盐类的影响：添加多种盐类，反应液的离子强度会增加，会导致体积传质系数值增加，其增加的程度随投入动力的增大而增大，有时为纯水的56倍。这主要原因是在盐类反应液中，气泡群变细小，并且难以合并，另外，气体的滞留量也有增大的倾向。但同样，离子浓度的增加，会导致氧溶解度的下降。,反应器结构因素的影响,搅拌器：搅拌器组数和搅拌器直径的最适距离对溶氧有一定的影响。实验表明，搅拌器组数和间距在很大程度上要根据发酵液的特性来确定，才能达到较好的溶氧效果。一般，当高径比为2.5时，用多组搅拌器可提高溶氧10%；当高径比为4时，采用较大的空气流速和较大的搅拌功率时，多组搅拌可提高溶氧25%。但是，如果搅拌器之间的位置不当，则流型和空气分布情况将发生变化，引起kLa的大幅度下降。,挡板：带有搅拌装置的反应器都应安装适当的挡板，或以垂直冷排管作为挡板，否则搅拌会使液体形成中心下降的漩涡。挡板可使液体形成某种轴向运动，不让大量空气通过漩涡外逸，从而提高气液混合效果，改善氧的传递条件。,高径比：当空气流量和单位体积的功率消耗不变时，通气效率随高径比的增大而增大。经验表明：高径比由1增大到2时，kLa可增大40%；由2增大到3时，kLa可增大20%。因此，发酵工厂倾向于采用较大的高径比。但是，高径比也不是越大越好。,空气分布管：管的形式，喷口直径，与罐底的相对位置对于溶氧速率有较大影响。,大型发酵罐搅拌装置,搅拌的影响,搅拌使气泡变小，增大气液相接触面积；延长气泡在液体中的停留时间；增加湍动程度，减小气泡外液膜厚度，减小阻力；使氧气、培养基成分和细胞均匀混合，利于营养物吸收，代谢物扩散。搅拌比通气速度对KL的影响更明显。但搅拌速度过高，会对细胞造成损伤，特别是菌丝，并会增加传热的负担。效率还与罐体积（越小越好）、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。,通气的影响,空气在上升过程中也能起到一定的搅拌作用随着通气量的增加，KL也随之增大，但当通气量大到了一定限度，通入的空气不能被有效打散成小气泡，搅拌器空转，反而造成KL下降，还会导致蒸发量增大，带走挥发性代谢产物,气升式发酵罐的特点1.反应溶液均匀分布；2.溶氧速率和效率高3.剪切力小:适于培养剪切力敏感的细胞；4.传热良好,发热量低；5.结构简单,易于加工制造；6.操作维修方便。,在工业上，还可采用液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来调节溶氧水平。溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成,一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。,溶解氧在发酵控制中的作用,溶氧异常往往意味着发酵出现问题1、操作故障或事故2、补料是否恰当3、是否染菌4、作为代谢方向的指标,