生化实验03斐林试剂比色法测还原糖含量.ppt

1,实验03 植物组织中还原糖含量的测定（斐林试剂比色法）,2,脱色的程度与溶液中还原性糖含量成正比关系。在590nm波长下比色测定吸光度，根据吸光度的减少值查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。,一、原理,植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。,还原糖具有自由的醛基和酮基，具有还原性。,在碱性、加热条件下，还原基团能把斐林试剂中CuSO4的Cu 2还原成Cu，生成Cu2O红色沉淀，蓝色的斐林试剂溶液因失出部分Cu 2而脱色。,3,材料：新鲜植物叶片 仪器设备：分光光度计、分析天平、低速离心机、水浴锅等 试剂：1.斐林试剂A液：40g CuSO45H2O溶解于蒸馏水定容至1.0L。2.斐林试剂B液：200g酒石酸钾钠（KNaC4H4O65H2O）与150g NaOH溶于蒸馏水中，并定容至1.0L。A、B两液分别贮存，使用前按1：1体积混合。（已配好）,二、材料、仪器设备及试剂,4,0.1葡萄糖标准液 烘干的纯葡萄糖100.00mg，加蒸馏水溶解定容至100ml 浓度：1.00 mg/ml（已配好）,斐林试剂（蓝色）,Cu2O 砖红色不溶于水,5,三、实验方法与步骤,1.标准曲线的制作 取5支试管编号，按下表分别加入各试剂。,6,处理方法：加斐林试剂后摇匀，加盖 沸水浴中15min，自然冷却转入离心管，平衡后放入离心机！离心：2500 r/min 5min 小心取出，取上清液测吸光值,7,标准曲线绘制：以葡萄糖量(mg)为横座标，吸光度差值(A590）为纵座标，在座标纸上绘制出标准曲线。,比色测定：用H2O作调0空白参比液！在590nm波长下测定各管的吸光度。,8,3.04.0g样品 加水研磨成匀浆后转入50ml大试管 80水浴20min（间歇震荡）冷却后转入100ml容量瓶定容、过滤后得到待测溶液。取待测液6.0ml进行测定（按制作标准曲线的步骤）。,2 样品还原糖提取与测定,9,W=g；VT=100 ml;Vs=6 ml;A590 及A590 填入工作曲线表作式作曲线图由工作曲线查得 样品的还原糖含量为C=?mg,四、数据记录,10,样品还原糖的含量（%）,五、结果计算,（X：根据标准曲线查得的糖质量mg；VT：提取液总体积（mL）；W：样品鲜质量（g）；Vs：测定时取用的样品体积（mL）；N：样品稀释倍数）,11,2种温度水浴处理，不可弄混离心机使用注意安全。思考：比较双缩脲试剂与斐林试剂的差异？思考：比较本实验与蛋白质测定实验中的化学原理差异？,注意事项与思考：,