教学课件：第十五章质谱法剖析.ppt

,质谱法(Mass Spectrometry,MS),质谱法(MS)：应用多种离子化技术，将物质分子转化为气态离子并按质荷比(m/z)大小进行分离并记录其信息，从而进行物质和结构分析的方法。,从20世纪60年代开始，质谱法普遍应用到有机化学和生物化学领域，化学家应用质谱图信息阐明各种物质的分子结构。质谱仪成为多数研究室及分析实验室的标准仪器之一。,灵敏度高响应时间短，分析速度快信息量大,质谱法特点,第一节 质谱法的基本原理和质谱仪,一、质谱法的基本原理,质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。,离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷Z有关，即,z为电荷数，e为元电荷，U为加速电压，m为离子的质量，为离子被加速后的运动速度。,(一)质谱图 以质荷比（m/z）为横坐标，以相对强度为纵坐标，并将最强的离子峰定为基峰，强度定为100%，其他离子峰以其对基峰的相对强度百分值表示。,二、质谱的表示方法,15-1 甲苯的质谱图,(二)质谱表,甲苯的质谱表,以表格形式罗列质数据，称为质谱表。,三、质谱仪,质谱仪的基本组成：真空系统、样品导入系统、离子源、质量分析器、离子检测器，其中离子源和质量分析器是质谱仪的两个核心部件。,15-2 质谱仪的组成,（一）真空系统 提供质谱仪的进样系统、离子源、质量分析器和检测器正常工作所需的真空状态。离子源真空度：1.310-4l.310-5Pa质量分析器和检测器真空度：l.310-6Pa,（二）样品导入系统 亦称进样系统，可高效重复地将样品引入离子源且不造成真空度的降低。常用的进样系统：间接式进样系统 直接探针进样系统 色谱联用进样系统,1.间接式进样系统,通过试样管将少量(10100g)样品引入试样储存器中，由于进样系统低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。由于进样系统的压强比离子源的压强大，样品离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透过高真空的离子源中。此种进样方式一般要求试样最好在操作温度下具有1.30.13Pa的蒸气压。,主要用于气体和易挥发试样,2.直接探针进样系统,主要用于热敏性固体、难挥发性固体和液体试样,在直接进样杆尖端装上少许样品(110ng)，经减压后送入离子源，快速加热使之气化并被离子源离子化。通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子源，对样品杯进行冷却或加热处理。,3.色谱联用导入系统,利用与质谱仪联机的气相色谱仪或高效液相色谱仪将混合物分离后，通过特殊系统的联机“接口”进入离子源，依次进行各组分的质谱分析,（三）离子源,其功能是将样品导入系统引入的气态样品分子转化成离子，同时发挥准直和聚集作用，使离子会聚成具有一定几何形状和能量的离子束进入质量分析器。,电离模式硬电离离方法：能给样品较大能量的电离方法软电离方法：给样品较小能量的电离方法，适用于易破裂 或易电离的样品,1.电子轰击源（EI）,组成：是一种硬电离方法。主要由电离室（离子盒）、灯丝（锑或钨灯丝)、离子聚焦透镜和一对磁极组成，只能用于小分子（400Da以下)的检测。,在离子源内，用电加热锑或钨丝到2000oC,产生高速的电子束,电子轰击法是通用的电离法，是使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子，即 Me M+2e,在灯丝和阳极之间加入70V电压，获得轰击能量为70eV的电子束，它与进样系统引入气体束发生碰撞而产生正离子。正离子在第一加速电极和反射极间的微小电位差作用下通过第一加速电极狭缝，至质量分析器电极狭缝，而第一加速极与第二加速极之间的高电位使正离子获得其最后速度，经过狭缝进一步准直后进入质量分析器。,EI源的优缺点：,优点：(1)非选择性电离，只要样品能气化，电离效率高；(2)应用最广;(3)稳定，操作简便。缺点：(1)样品必须能气化，不适宜难挥发、热敏性的物质;(2)有的化合物在EI方式下分子离子不稳定，易碎裂，得不到分子量信息。,2.化学电离源（CI）,化学电离法是待测物通过气相分子一离子反应来进行的。核心是质子的转移。CI源结构(与EI源相似):电离室（离子盒）、灯丝（锑或钨灯丝)、离子聚焦透镜和一对磁极组成。,化学电离源常用的反应气是CH4、异丁烷、NH3、H2O、H2或He等。在高能电子流的轰击下，反应物(如CH4)首先被电离，生成一次离子CH3+和CH4+，即CH4+eCH4+2eCH4+CH3+H,一次离子CH3+和CH4+快速与大量存在的CH4分子发生离子-分子反应，生成二次离子CH5+和C2H5+，即 CH4+CH4CH5+CH3CH3+CH4 C2H5+H2,样品(试样与甲烷之比为1:1000)导入离子源，试样分子(M)与试剂离子以下列方式进行反应，转移一个质子给试样或由试样移去一个H+或电子，试样则变成带M+的离子。CH5+(C2H5+)+M(M+H)+CH4(C2H4)CH5+(C2H5+)+M(M-H)+CH4(C2H6),(M+H)+或(M-H)+可能碎裂，产生碎片离子。(M+H)+或(M-H)+称为准分子离子，由(M+H)+或(M-H)+离子测得其相对分子质量。,CI源的优缺点：,优点：(1)属于软电离方式，准分子离子峰强度大，便于利用(M+H)+或(M-H)+峰准确推断分子量(2)易获得有关化合物基团的信息(3)适宜做多离子检测,缺点：(1)CI图谱与实验条件有关，不同仪器获得的CI图不能比较或检索，因此一般不能制作标准图谱(2)碎片离子少，缺少样品的结构信息(3)样品需加热气化后进行离子化，故不适合于热不稳定、难挥发物质的分析,3.快原子轰击源(FAB),FAB源的优缺点：,优点：(1)广泛应用的软电离技术，易得到较强的分子离子或准分子离子，由此获得化合物分子量的信息；(2)在离子化过程中样品无需加热气化，离子化能力强，对强极性、难气化化合物也能电离，故适合于热不稳定、强极性分子、生物分子及配合物的分析。,缺点：重现性差，对于非极性化合物灵敏度低，且基质在低质量数区(400Da)以下产生较多干扰峰,4.大气压电离源(API),是在大气压下的质谱离子化技术的总称，包括电喷雾离子化（ESI）、大气压化学离子化(APCI)和大气压光喷雾离子化(APPI)等技术，ESI和APCI是液相色谱-质谱联用的接口。,电喷雾离子化(ESI),5.基质辅助激光解吸电离源(MALDI),MALDI广泛应用于多肽、蛋白质、低聚核苷酸和低聚糖,可测分子量达40万Da以上。MALDI与飞行时间(TOF)联用已经成为生命科学研究中非常重要的工具。,（四）质量分析器,依据不同方式将样品离子按质荷比m/z分开，得到按质荷比大小顺序排列的质谱图,质量分析器的主要类型有：磁质量分析器、四极滤质器、飞行时间分析器、离子阱质量分析器和离子回旋共振分析器等,1.磁质量分析器,最常用的分析器类型之一就是扇形磁分析器。离子束经加速后飞入磁极间的弯曲区，由于磁场作用，飞行轨道发生弯曲。,单聚焦质量分析器,单聚焦质量分析器工作原理:离子在离子源中被加速后，飞入磁极的弯曲区，受磁场作用而作匀速圆周运动，由于磁场作用使飞行轨道发生弯曲，此时离子受到磁场施加的向心力作用，且离子的离心力也同时存在，只有在上述两力平衡时，离子才能飞出弯曲区。分辨率可达5000。该仪器不能对不同动能(能量)的离子实现聚焦。若要求分辨率大于5000，则需要双聚焦质量分析器。,双聚焦质量分析器,2.四级质量分析器,由四根平行的金属杆组成，理想的四杆为双曲线，但常用的是四支圆柱形金属杆，被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔。,四级杆质量分析器,四级质量分析器工作原理:被加速的离子束穿过对准四根极杆之间空间的准直小孔，通过在四极上加上直流电压U和射频电压Vcost，在极间形成一个射频场，正电极电压为UVcost，负电极为-(UVcost)。离子进入此射频场后，会受到电场力作用，只有合适m/z的离子才会通过稳定的振荡进入检测器。只要改变U和V并保持U/V值恒定时，可以实现不同m/z的检测。,3.飞行时间分析器(TOF),这种分析器的离子分离是用非磁方式达到的，因为从离子源飞出的离子动能基本一致，在飞出离子源后进入一长约lm的无场漂移管，不同m/z离子到达终点时间差为:,4.离子阱质量分析器,通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置。常见的有两种形式：一种是离子回旋共振技术，另一种是下述较简单的离子阱,离子阱质量分析器,离子阱由一环形电极上下各一端罩电极构成,以端罩电极接地，在环电极上施以变化的射频电压，此时处于阱中具有合适的m/z的离子将在环中指定的轨道上稳定旋转，若增加该电压，则较重离子转至指定稳定轨道，而轻些的离子将偏出轨道并与环电极发生碰撞。当电离源产生的离子由上端小孔进入阱中后，射频电压开始扫描，陷入阱中离子的轨道则会依次发生变化而从底端离开环电极腔，从而被检测器检测。,（五）检测系统,离子检测器(ion detector)的功能是接受由质量分析器分离的离子进行离子计数并转换成电压信号放大输出，经计算机采集和处理，得到按不同质荷比m/z值排列和对应离子丰度的质谱图。质谱仪常用的检测器有法拉第杯(Faraday Cup)、电子倍增管及微通道板、闪烁计数器等。,（六）质谱仪的主要性能指标,1.质量范围(mass range)质谱仪能够进行分析的样品的相对原子质量(或相对分子质量)或m/z最小到最大的质量范围。通常采用原子质量单位(unified atomic mass unit，符号amu)进行度量。,2.分辨率(R)指质谱仪分开相邻质量离子的能力。,其中m1、m2为质量数，且m1m2，故在两峰质量数较小时，要求仪器分辨率大。,质谱仪10%峰谷分辨率,第二节 质谱中的主要离子及其裂解类型,一、质谱中的主要离子,（一）分子离子,化合物分子通过某种电离方式，失去一个外层价电子而形成带正电荷的离子称为分子离子(Molecular ion)。,M+e M+2e,（二）碎片离子,分子离子产生后可能具有较高的能量，将会通过进一步碎裂或重排而释放能量，碎裂后产生的离子形成的峰称为碎片离子峰(fragment ion),（三）亚稳离子,质量为m1的离子离开离子源进入质量分析器，由于碰撞等原因，在飞行过程中进一步裂解失去中性碎片而形成低质量的离子，一部分能量被中性碎片带走，此时的离子比在离子源中形成的m2+离子能量小，且很不稳定，这种离子称为亚稳离子，用m*表示,m*表观质量与m1+和m2+关系是：,苯乙酮的质谱图,（四）同位素离子,有些元素具有一定自然丰度的同位素，所以在质谱图上出现一些Ml，M2的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。,常见元素的稳定同位素相对丰度,二、阳离子的裂解类型,（一）单纯开裂(cleavage only),仅一个化学键发生断裂称单纯开裂。化学键(键)断裂时，电子分配通常有均裂、异裂及半异裂3种方式。,均裂 如果成键电子被两碎片各保留一个，称为均裂。,例如：脂肪酮可发生键均裂：若R1R2，则：,2.异裂两个成键电子都归属于某一个碎片，称为异裂。,例如：脂肪酮可发生键异裂：若R1R2，则:,3.半异裂已离子化的键的开裂过程,例如：烷烃游离基可发生半异裂：,（二）重排开裂(rearrangement cleavage),质谱中某些离子通过断裂两个或两个以上化学键重新排列形成，这种裂解称为重排开裂。质谱图上相应的峰称为重排离子峰。重排离子峰是分子离子在裂解成碎片时，某些原子或基团重新排列或转移而形成的离子，称为重排离子。,重排类型:麦氏重排(Mclafferty重排)逆狄-阿重排(Retro-Diels-Alder重排),Mclafferty重排 可发生麦氏重排的化合物是酮、醛、酸、酯、酰胺、羰基衍生物、烯、炔及烷基苯等，是一些含有C=O、C=N、C=S、C=C及苯环的化合物，且与该基团相连的键上具有-H原子时，通过六元过渡态，-H转移到杂原子或双键碳原子上，同时发生键的断裂，形成一个中性分子(烯烃)和一个偶质量数的奇电子离子(OE+)。,这种重排通式如下：,例如，2-已酮的质谱中出现很强的m/z 58峰就是麦氏重排所形成的。,2Retro Diels-Alder重排 不饱和环的开裂遵循反狄尔斯-阿尔德反应，简称RDA。1,3-丁二烯与乙烯化合物裂解产生一个六元环烯的化合物的反应，称为Diels-Alder反应。在质谱中，环己烯裂解成一离子化的共轭双烯化合物(或衍生物)和乙烯分子(或其衍生物)，故称为RDA重排。途径是由单电子引发，经过两次断裂，即反狄-阿反应，形成一个中性分子和离子化双烯衍生物。,例如：1,8-萜二烯通过RDA重排，生成乙烯衍生物和丁二烯离子。,第三节 质谱分析法,一、分子式的测定,（一）分子离子峰的识别,分子离子峰位于质谱图中m/z值最大的位置，处于质谱图的最右端。但质谱图中最右端的峰，不一定就是分子离子峰。,确定分子离子峰时需考虑以下几点：,1.分子离子峰的质量必须符合氮数规律 2.有机化合物分子离子峰稳定性(相对强度)顺序 3.分子离子峰与其相邻质荷比较小的碎片离子的 质量差应合理 4.分子离子峰的强弱与实验条件有关 5.考虑准分子离子峰M+1和M-1峰,（二）相对分子质量的测定,对于有一定挥发性、能得到其质谱图的化合物，用质谱法测定其相对分子质量是最快、最精确的方法，因为质谱图中一般分子离子峰的质荷比在数值上就等于该化合物的相对分子质量，所以准确地确认分子离子峰十分重要。,（三）分子式的确定,1.由同位素离子峰确定分子式,拜诺(Beynon)等人计算了分子质量在500以下，只含C，H，O，N的化合物的同位素离子峰(M+2)+，(M+1)+与分子离子峰的相对强度，测定分子离子及碎片离子的质量(以M+峰的强度为100)，编制成表，称为Beynon表。只要质谱图中(M+2)+，(M+1)+峰能准确测量其相对强度，由Beynon表便可确定分子式。,Beynon表中M=126部分,2.高分辨质谱精确测定分子质量,由高分辨的质谱能精确测得化合物的精确质量，将其输入计算机的相应数据处理系统(数据库系统)即可得到该分子的元素组成，从而确定分子式,即数据对照与分子的检索由计算机完成。该法准确、简便，是目前有机质谱中应用最多的方法。,如高分辨质谱测定某化合物的相对分子质量为126.0328，由同位素推测该化合物不含S、Cl、Br、Si等元素。将上述信息输入计算机，给出下表所示的可能分子式。,质量数(126)化合物可能组成,其中1、3不符合氮数规律，2写不出合理的结构式，该化合物最合理的分子式应为C6H6O3。此结论得到了IR和NMR谱的证实。,二、有机化合物的结构鉴定,（一）几种有机化合物的质谱,1.烃类,(1)烷烃：分子离子峰强度弱，且随碳链增长而降低；有相差14个质量数的一系列奇质量数的峰，强度 逐渐减弱。,m/z 43和m/z 57的峰强度较大。在比CnH2n+1离子小一个质量数处有一个小峰，即CnH2n 离 子峰，是由H转移重排成的；支链烷烃的裂解首先出现在分支处，以丢失最大烃基为最稳定。,4-甲基十烷的质谱图,(2)烯烃：分子离子峰比烷烃强；与直链烷烃质谱有相似的规律，易生成质量数相差14的CnH2n+1碎片离子峰(m/z 27、41、55、69)；容易发生裂解得到烯丙基离子峰；烯烃含C和H，发生麦氏重排形成偶质量数的重排峰。,(3)芳烃：分子离子稳定，有较强的分子离子峰；烷基取代苯易发生裂解，经重排产生m/z 91特征的卓鎓离子；由于卓鎓离子稳定，成为许多取代苯如甲 苯、二甲苯、乙苯、正丙苯等的基峰。,产生卓鎓离子m/z 91的基峰，进一步失去乙炔，产生m/z 65的环戊二烯正离子及m/z 39的环丙烯离子：,烷基苯的裂解产生m/z 77的苯基离子(C6H5+)峰，进一步裂解产生环丙烯离子及m/z 51的环丁二烯离子：,具有-H的烷基取代基苯，能发生Mclafferty重排裂解，产生m/z 92重排离子：,综上所述，烷基取代苯的特征离子为卓鎓离子C7H7+(m/z 91)、C6H5+(m/z 77)、C5H5+(m/z 65)及C3H3+(m/z 39)等离子。,2.饱和脂肪醇,分子离子峰很弱，因为容易失去一个H2O，往往观察不到；易发生断裂，生成一组氧鎓离子；易发生脱水重排反应，产生M-18离子；直链伯醇会出现羟基离子、烷基离子及烯烃离子，因此质谱峰较多。,3.醛和酮,（1）醛,分子离子峰较强，芳香醛的分子离子峰更稳定 易发生-断裂产生醛R+(芳醛Ar+)、m/z 29(CHO+)及 M-1的准分子离子峰。M-1是醛类的特征峰。,具有氢的醛，能发生麦氏重排，随取代基不同可得到m/z 44，58，72的离子峰，一般是基峰，表明高级脂肪醛的麦氏重排裂解是主要的。可根据麦氏重排后的碎片峰判断C上的支链大小。,长链脂肪醛还可发生裂解，生成无氧碎片离子峰m/z 29、43、57(29+14n)。,（2）酮,酮的断裂与醛相似，重要的是断裂，酮羰基(C=O)两侧都可以发生，遵守丢失最大烃基规则；酮类有明显的分子离子峰m/z 58(C3)、72(C4)、86(C5)及断裂后形成的m/z 4314 n 峰都是重要的峰。断裂后较大的酰基还可丢失中性分子CO得到烷基正离子。,具有-H的醛，能发生麦氏重排,4.羧酸,一元脂肪酸及其酯的分子离子峰是中-弱峰；芳酸及其酯有较强的分子离子峰易发生断裂产生+OC-OR1、OR1、R-CO+及R1+离子。,具有氢的酸和酯，能发生McLafferty重排，其重排过程产生m/z 60的强特征离子峰。,芳香羧酸分子离子峰强，其主要峰由失去OH(M-17)和失去CO2H(M-45)形成。若邻位基团中带氢，失去水(M-18)的峰为主要峰。,5.含氮化合物,（1）脂肪胺类,脂肪胺的分子离子峰较弱，甚至不出现；易发生裂解而产生亚胺正离子，优先丢失最大烃基，最终获得m/z 3014n的离子；伯酰胺在R-CONH2键处断裂(O=C=N+H2)，在m/z 30处出现强峰。,（2）芳胺类,芳胺的分子离子峰很强，苯胺失去1个氨基上的氢原子得到中等强度的M-1峰伯胺易失去HCN(M=27)和H2CN(M=28)，苯胺可产生明显的m/z 66和65的环戊二烯离子峰：,有烃基侧链的苯胺发生苄基断裂生成m/z 106的氨基卓基：,（3）酰胺类,酰胺的分子离子峰较弱具有羰基化合物的开裂特点，易发生裂解而产生O=C=+NHR、+O=C=NHR、+NHR及R-CO+离子,6.有机卤化物,它们的同位素峰较强；卤化物的主要碎片有：M-R、M-X、M-HX和R+、X+离子；脂肪类卤化物的-断裂可产生M-R或M-X峰；长链卤化物的开裂，丢失一个自由基得到较强的(M-R)离子峰(C4H8Br+)，有时是基峰，可能是形成的五元环较稳定的缘故。,（二）有机化合物的质谱解析,1.由质谱图中高的m/z值端确定分子离子峰，确定分子量，并从分子离子峰的强弱初步判断化合物的类型及是否含有Cl、Br、S等元素2.根据同位素丰度或高分辨质谱数据确定分子离子和重要碎片离子元素组成，并确定可能分子式3.由分子式计算化合物的不饱和度，确定化合物中双键和芳环的数目,式中n1、n2、n4分别代表一、三、四价原子的个数。,4.研究质谱的概貌，判断分子性质，对化合物类型进行归属5.根据重要的低质量离子系列、高质量端离子和丢失的中性碎片后及中性碎片等信息，并参考其它光谱数据，列出可能的分子结构6.根据标准化合物的质谱图及其它的信息，进行筛选验证确定化合物的组成,