教学课件：第五章-灭菌与空气的净化.ppt

第五章 灭菌与空气的净化,灭菌的基本原理培养基和发酵设备的灭菌空气的除菌,本章主要内容,第一节 灭菌的基本原理,一.灭菌的原理和方法,灭菌(disinfection)：用物理或化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。,消毒(sterilization)：用物理或化学的方法杀灭物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死孢子。,无菌(asepsis)：不存在活菌，多是灭菌的结果。,工程上灭菌：是指使用物理或化学方法将培养基及发酵设备中的杂菌的细胞和孢子杀灭至不影响发酵为限。灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。,消毒灭菌的方法,（一）物理消毒灭菌法（二）化学消毒法,（一）物理消毒灭菌法,1.热力灭菌法 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类。在同一温度下，后者效力比前者为大，这是因为：（1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固；（2）湿热的穿透力比干热大；（3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。,湿热灭菌法,1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸5分钟即被杀死。细菌芽孢常需煮沸1小时，才被杀死。水中加入 2%碳酸钠，既可提高沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭，又可防止金属器皿生锈。2.巴氏消毒法（pasteurization）:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营 养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。,3.间歇灭菌法（fractional sterilization）:是利用反复多次的流通蒸汽加热，杀死细菌所有 繁殖体和芽胞的灭菌法。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内，100 加热1530分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸 汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽 灭菌器内进行的。加热时蒸汽不能外溢，容器内温度随蒸汽压的增加而升高，杀菌力也大为增强。通常 在1.05kg/cm2的压力下，温度达121.3,维持1530分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌。,灭菌锅,湿热灭菌使用的设备,2.紫外线与射线灭菌法,1.紫外线：紫外线的杀菌作用与其波长有关，通常紫外线波长为240280nm时具有杀菌作用，其中 以260nm最强。2.电离辐射：高速电子、X 射线和射线等在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。电离辐射常用于大量一次性医用塑料制品的消毒。,3.过滤除菌,过滤除菌是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。过滤除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、细菌毒素、抗生素，以及空气等的除菌。滤菌器的种类很多，目前常用的有滤膜滤菌器、石棉滤菌器（亦称Seitz滤菌器）、玻璃滤菌器等。,（二）化学消毒法,用化学药品进行消毒的方法，由于化学药品对细菌及人体都有毒性，故只能用于体表、医疗器械及周围环境等的消毒。杀菌机制：（1）使菌体蛋白质变性或凝固；（2）干扰细菌的酶系统和代谢；（3）影响细菌胞浆膜的通透性。,二.湿热灭菌的原理及影响因素,1.湿热灭菌的原理,湿热灭菌：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障而死亡。,致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：表示微生物对热的抵抗能力，指微生物在某一条件下（主要是温度）的致死时间。芽孢的热阻特别高。,概念：,枯草芽孢体,2.微生物的热死规律对数残留定律,微生物热死：微生物受热失活直到死亡。微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固，丧失活力所致。,对数残留定律：湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡（个数减少）的速度与残有的微生物数量成正比。-dN/dt=kN；N：培养基中微生物的个数，t：时间，k：比死亡速率。从0 t，N0 Nt积分上式可得：,t=,2.303,k,Lg N0,Nt,随时间的延长，加热灭菌的残存菌数呈对数减少，且温度越高，死亡越快。灭菌时间取决于污染的程度（N0），灭菌的程度（残留菌数Nt）和k值。,K值：微生物耐热性的一种特征，随微生物种类和 灭菌温度而异。温度相同，k值越小，微生物愈耐热。对于同一微生物，灭菌温度越低，k值愈小。提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间缩短。,通常必要的灭菌条件是110130，520min。芽孢对热耐受强，并不始终符合对数残留定律。培养液灭菌多采用高温短时间加热的方式。一般以芽孢细菌和细菌芽孢的数量合作为依据来计算灭菌时间。在实际操作中，要达到Nt0，即t为，是不可能的，因此，在设计时常采用 Nt0.001。,一、培养基灭菌温度的选择,培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死，营养成分也遭到破坏；高压加热情况下，氨基酸、维生素极易被破坏。因此必须选择一个能达到灭菌的目的又能使培养基中营养成分破坏至最小的灭菌工艺条件。,第二节 培养基和发酵设备的灭菌,动力学分析,1.培养基的破坏反应动力学,大部分的培养基的破坏为一级分解反应，动力学方程如下 dc/dt=-kcc反应物的浓度，mol/L;t反应时间，min；k化学反应速率常数（随温度及反应类型而变），min-1 用阿伦尼乌斯方程表示 kAe-E/RT,A频率因子；E反应所需的活化能J/mol；R气体常数，8.314 J/mol*KT绝对温度，K,2.杂菌的死亡动力学,杂菌的死亡也属于为一级动力学类型，动力学方程如下 dN/dt=-kN 用阿伦尼乌斯方程表示 kAe-E/RT,A频率因子；E杀死微生物所需的活化能，J/mol；R气体常数，8.314 J/mol*KT绝对温度，K,在灭菌时，温度由T1升高到T2，灭菌速率常数k和培养基成分破坏速率常数k的值为：k1=Ae-E/RT1 ln(k2/k1)=E/R(1/T1-1/T2)(1)k2=Ae-E/RT2 k1=Ae-E/RT1 ln(k2/k1)=E/R(1/T1-1/T2)(2)k2=Ae-E/RT2 ln(k2/k1)E(1)/(2)=1 ln(k2/k1)E,灭菌时活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E,因此，采用高温瞬时灭菌法较好,ln(k2/k1)ln(k2/k1),1,1.分批灭菌,指将配制好的培养基放入发酵罐中，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，也称实罐灭菌。,二、培养基的灭菌方法,.升温阶段 升温方式：在夹套和蛇管中通入蒸汽间接加热；在培养基中直接通入蒸汽加热。培养基温度不太高时，相应k值非常小，灭菌效果可以忽略不计，因此，在升温阶段可以认为只有在温度高于100 时才有灭菌作用。,.保温阶段 灭菌的主要时段，习惯上把保温时间看作灭菌时间。此时，k值不变，培养基温度恒定，则保温时间为：t=2.303/k lg(N1/N2),.冷却阶段培养基灭菌后用冷却水间壁将培养基冷却至培养所要求温度的过程。,2.连续灭菌,培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，也称“连消”。,连续灭菌的方法,（1）喷射加热连续灭菌（2）薄板换热器连续灭菌（最先进的灭菌方式）（3）喷淋冷却连续灭菌（最基础的灭菌方式）,喷射加热连续灭菌,典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图,薄板换热器连续灭菌,薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图,3.固体培养基灭菌,利用转鼓式灭菌机，装料后旋紧进出口盖，旋转转鼓使培养基得到翻动，蒸汽沿轴中心通过加热培养基达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌完毕后用真空泵沿空心横抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。,4.补料液的灭菌,灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。,三.影响培养基灭菌的因素,培养基成分：油脂、糖类及蛋白质的浓度越大，灭菌的温度越高；低浓度（12）的Nacl溶液对微生物的耐热性有保护作用，而浓度达810以上，则减弱微生物的耐热性 pH：培养基的pH越低，灭菌时间越短 培养基中颗粒：颗粒越小，灭菌越容易 泡沫：培养基形成泡沫对灭菌不利,四.培养基灭菌时间的计算,培养基分批灭菌时间的计算,例.有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2105个耐热细菌芽孢，121 时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败几率为0.001时所需要的灭菌时间。假设不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是保温阶段被杀灭,可简单的利用t=2.303/k lg(N1/N2)粗略地计算灭菌所需要的时间。,解：N1=401062105=81012,N2=0.001，,K=1.8min-1,灭菌时间:t=2.303/klg(N1/N2)=2.303/1.8lg(81015)=31.5min,题解,培养基连续灭菌时间的计算,培养基中的含菌数以1mL培养基的含菌数来计算，计算公式如下：t=2.303/klg(c0/ct)C0单位体积培养基灭菌前的含菌个数，个/mLCt单位体积培养基灭菌后的含菌个数，个/mL,例 题,有一发酵罐内装40m3培养基，在131温度下进行连续灭菌。原污染程度为每1mL有2105个耐热细菌芽孢，131 时灭菌速度常数为1.5min-1。求灭菌失败几率为0.001时灭菌所需要的维持时间。,题解,t=2.303/klg(c0/ct)C02105（个/mL)k1.5min-1ct 1/（40106103）2.510-11（个/mL）t=2.303/k lg(c0/ct)24.4（min）,五、分批灭菌和连续灭菌的比较,连续灭菌,优点：可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡采用板式换热器时可节约大量能源适宜采用自动控制，劳动强度小适用于大规模生产,缺点：不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加了染菌的几率。,分批灭菌,优点：设备投资较少不需要其他附属设备 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜；缺点：加热和冷却的时间较长，营养成分有一定的损失；罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺；只适用于中小型发酵罐。,六、发酵设备的灭菌,习 题,为什么培养基的灭菌最好采用高温瞬时灭菌法？,第三节 空气的除菌,A.空气除菌的方法,获取无菌空气的方法由多种，如辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。工业生产物常用制备无菌空气的方法,热灭菌法：加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性所致空气进入培养系统前，需压缩，所以就利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌。,2.静电除菌 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷。直径很小的微粒，其所带的电荷很小，所以静电除尘灭菌 对很小的微粒效率很低。,3.介质过滤除菌法：是目前获得大量无菌空气的常规方法让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物而获得无菌空气。,空气中的微生物大多是细菌和芽孢，还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。这些微生物在空气中极少单独游离存在，基本上是附着于灰尘、液滴等微生物的表面上。介质过滤除菌就是把空气中的各种微生物和极少量的游离生物捕集起来予以除掉。,空气过滤除菌的介质1.纸类过滤介质：滤纸、玻璃纤维纸（36层）优点：过滤效率高，对于大于0.3m的颗粒的去除效率为99.99以上，阻力比较小，压降较小。缺点：强度不大，受潮后强度更差，（实际生产中，在纸浆中添加750的木浆来增加其强度）,滤纸,显微镜下的滤纸,玻璃纤维纸,2.纤维状或颗粒状过滤介质,棉花玻璃纤维活性炭,优点：材料不易损坏，取材容易。缺点：对0.3m以下的颗粒的过滤效率仅为99，难以满足发酵工业的无菌要求，需多次过滤；体积大，占有空间大，操作困难，装填料介质费时费力，介质装填的松紧程度不易掌握，空气压降大；介质灭菌和吹干耗用大量蒸汽和空气。,玻璃纤维,活性炭,3.微孔滤膜类过滤介质,特点过滤介质的孔径能小于0.1m，能将空气中的细菌真正滤去；易于控制过滤后空气的质量；节约能量和时间，操作简便；使用前需预处理，以除去空气中的油和水，以此提高过滤膜的使用寿命。,微孔滤膜,微孔滤膜,介质过滤效率,介质过滤效率是指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比（N1-N2）/N1=1-N2/N1=1-PN1过滤前空气中的尘埃颗粒数；N2过滤后空气中的尘埃颗粒数；过滤效率，；P穿透率,对数穿透定律,经过滤床厚度中的一段微小长度dL后，空气中颗粒数的减少数dN可以用下式表示：dNKN dLN空气中尘埃数（个）；L滤床厚度（cm）；K常数。ln（Ns/N0）-KL L1/Kln（N0/Ns）一般取Ns10-3来计算,影响介质过滤除菌的因素,过滤介质纤维直径大小：介质纤维直径越小，过滤效率越高对于相同过滤介质：介质滤层厚度越高，过滤效果越好；介质填充密度越大，过滤效果越好；空器流速很低时，过滤效果随气流流速的增加而降低，当气流流速增加至临界值后，过滤效果随气流流速的增加而提高。,B.空气净化的流程,空气吸气口 粗过滤器 空气压缩机 一级空气冷却器 二级空气冷却器 分水器 空气贮罐 旋风分离器 丝网除沫器 加热器 总空气过滤器 分空气过滤器 无菌空气,提高除菌效率的措施 1.减少进口空气的含菌数：加强生产场地的卫生管理，减少生产环境空气中含菌数；正确选择进风口，压缩空气站应在生产车间的上风向；提高进口空气位置；加强空气压缩前预处理。2.设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。3.设计合理的空气预处理设备。4.降低进入空气过滤器的空气的湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作：使用无润滑油的空压机；加强空气冷却和去油、水；提高进入过滤器的空气温度，降低其相对湿度。,C.空气的预处理,空气预处理的目的空气的预处理主要以除去油、水和较大的颗粒为目标。,空气的预处理的流程（根据不同的情况选择合适的流程),将压缩空气冷却至露点以上，使进入过滤器的空气相对湿度为6070以下。利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气温度升高，降低相对湿度。,将压缩后的空气部分冷却析水，另一部分的热空气直接与冷却析水后的空气混合，然后进入空气过滤器。将压缩空气冷却至露点以下，析出部分水分，然后升温使相对湿度为60左右，进入空气过滤器，根据气候情况而有一次冷却一次析水流程，二次冷却二次析水流程。,