教学课件第五篇病毒的遗传与变异.ppt

1,第五章 病毒的遗传与变异,2,第五章 病毒的遗传与变异,遗传和变异是生命的基本特征 遗传是生物体亲代和子代间的形态结构等相似性；它保持物种的相对稳定性，维系生物界的平衡。变异是亲代与子代个体间的差异；可导致新的生物品种出现，孕育生物的进化。,3,第五章 病毒的遗传与变异,自然界的任何物种都存在变异，变异是生物适应环境和维持生存的一种重要方式，是生物进化的规律。但不同物种变异速率不一，病毒是变异率比较高的微生物。一方面病毒的复制频率很高，遗传物质很容易在复制过程中发生突变；另一方面病毒在宿主体细胞内复制繁殖，必然要遭到宿主免疫系统的攻击（称之为免疫压力），因而变异则成为逃避免疫杀伤的最好方式。,4,第五章 病毒的遗传与变异,病毒是一类极为简单的分子生物，核酸是遗传的物质基础，核酸复制的忠实性使病毒具有稳定的遗传表现。但由于病毒没有细胞结构，其遗传物质极易受外界环境及细胞内分子环境的影响而发生改变，病毒与其它生物相比，其遗传具有更大的变异性。,5,病毒的变异,病毒的变异主要源于：1）基因组的突变2）基因组的重组,6,本章内容：1.病毒的突变 2.病毒的重组 3.影响病毒表型的病毒间相互作用 4.哺乳动物病毒表达载体,7,1.病毒的突变,1.1.突变及有关的概念 突变:病毒遗传物质-核酸的组成或结构发生改变.突变体:携带突变的生物个体或群体或株系.突变基因:包含突变位点的基因.,8,1.病毒的突变,1.1.突变及有关的概念野生型病毒（wild type）:指原来的，通常是实验室适应的,并用其进行突变体选择和比较的病毒株.株（strain）:区分同一病毒的不同野生型.型（type）:感染性中和作用确定的血清型.变异株（variant）:用来表示表型和野生型不同,但遗传学依据还不清楚的病毒株.,9,1.病毒的突变,病毒突变一般分为自发突变和诱导突变。自发突变是在没有任何已知诱变剂的条件下，病毒子代产生高比例的突变体，最后导致表型变异。诱导突变则是利用不同的物理或化学诱变剂处理病毒，提高病毒群体突变率，诱导病毒子代出现特定的突变类型。,10,1.2自发突变,DNA病毒中自发突变率低,RNA病毒中自发突变率高.原因:RNA基因组复制置信度低,复制酶中缺少校正阅读活性.自发突变的结果:很难保持一个完全同源的病毒种群.,11,1.3.诱发突变,诱发突变:利用自然界各种物理或化学诱变剂处理野生型病毒,提高病毒群体中的突变率.诱变剂计量:以达到既能增加所需表型的突变率,又能将每个病毒基因组多重突变率降低到最低.,12,诱变剂类型及机制:类型:体外诱变剂:直接对核酸进行化学修饰，不影响核酸复制 体内诱变剂:体内诱变剂，需进行代谢活化，它们可掺入到新复制的核酸中，并在不断的复制过程中诱发突变。UV辐射,13,诱变剂机制,机制:体外诱变剂:对病毒的静态核苷酸进行 化学修饰,使其在后面的复制中碱基配对发生改变,导致同型碱基置换和异型碱基颠换.有亚硝酸、羟胺、烷化剂等.,14,机制：体内诱变剂:一组为碱基类似物,一组为插入剂.碱基类似物在核苷酸复制时按照正常的碱基配对规则结合到核酸中,继而发生异构互变,在随后的复制中导致它们与不同的碱基配对,造成碱基的转换和颠换.插入剂有疏水表面的扁平分子可插入核酸的相邻而重叠的碱基之间,引起碱基堆积畸变,复制时,碱基增加或缺失,发生移框突变.,15,机制紫外线，可诱发嘧啶二聚体的形成，该二聚体可被光复活酶识别而解聚，该过程是一个易错修复过程，可导致较高的突变频率。紫外线也可造成RNA改变，但其作用机制尚不清楚。,16,1.4.病毒突变类型,位点突变和缺失突变位点突变是指病毒基因组的核苷酸碱基发生了改变，这就使由基因组控制的病毒多肽的特性受到影响。碱基改变导致某个氨基酸的变化，有时该氨基酸的改变不影响蛋白质的构型和稳定性，此时基因组的表型仍维持原状。如果改变的氨基酸位于蛋白结构的重要位置，那么多肽的正常功能就会丧失，此称错义突变。,17,位点突 变,核苷酸碱基发生改变,某个氨基酸的变化,不影响蛋白质的构型和稳定性,位于蛋白结构的重要位置,基因组的表型仍维持原状,多肽的正常功能就会丧失,18,位点突变和缺失突变,缺失突变是指病毒基因组的一部分被丢失，从而使病毒的特性发生改变。如果缺失的那部分核酸序列是无关紧要的，那么病毒的表型不会受到明显影响；如果是关键部分，则病毒将失去独立繁殖的能力，甚至是致死性的。,19,从引起突变的遗传信息的意义改变来分:同义突变:没有改变产物氨基酸序列密码子变化.错义突变:碱基序列-改变-产物氨基酸序列密码子改变.无义突变:碱基-改变-产物氨基酸密码子变为终止密码 子,翻译终止，生成该蛋白质的氨基末端片段产物。,20,1.4.病毒突变类型,从突变效应(背离或回到)野生型来分:正向突变:改变了野生型性状.回复突变:失去的野生型性状二次突变后得到恢复.,21,1.4.病毒突变类型突变发生的基因调控区分:组成型突变、启动子上升、下降、抗阻遏、抗反馈五类.突变带来的表型改变分:形态突变体:是指造成宿主细胞形态改变的突变体 条件致死突变体:是指在某一条件下具有致死效应而在另一条件下没有致死效应的突变体，例如：温度敏感突变体（ts）生化突变体:营养缺陷或抗药物,22,1.5.几种动物病毒突变体,无效突变体：病毒的一个基因完全失活。非必需基因 必需基因 温度敏感突变体：非允许、允许温度下蛋白质功能的变化 是指在较低温度下繁殖，但在较高温度下不能繁殖，而相应的野生型在这两种温度都能繁殖的突变体。,23,1.5.几种动物病毒突变体,蚀斑突变体 蚀斑 大小、形状与野生型相比有变化(1)蚀斑的大小-决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒复制、成熟、释放的速度和在细胞内外的死亡率。(2)蚀斑的色泽-蚀斑是透明的还是混浊的，是有色的，还是无色的，这主要决定于蚀斑及其周缘的细胞死亡与溶崩情况。(3)蚀斑的形状-蚀斑是圆的还是不规则的？蚀斑边缘是清晰，还是弥撒，这与病毒的弥撒率及其导致的细胞病变率有关。,24,1.5.几种动物病毒突变体,宿主范围突变体:基因突变而扩大了感染宿主细胞范围，及时发现有利于监控疾病。如禽流感病毒 人 抗药性突变体:导致病毒毒力改变的特异突变；形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。这种现象随着病毒化学治疗药物的增多，耐药现象可能将成为病毒化学治疗中一个需要充分注意和解决的问题。,25,1.5.几种动物病毒突变体,抗原突变体 外壳蛋白抗原性 病毒抗原性差别的表现。如流感病毒的变异，具体表现为表面抗原(血凝素和神经氨酸酶)的变异 回复突变体 回变的三条途径：核苷酸回变、突变基因另一点突变、突变基因外一基因突变,26,2.病毒的重组,2.1.病毒的重组机制 病毒重组:两个或多个病毒颗粒的遗传物质重配于子代重组体病毒中,病毒重组体含有两个或多个亲代病毒基因的核酸序列,出现与亲代病毒不同的基因型和表型.,27,重组,classicrecombination,common in DNA viruses,28,2.1.病毒的重组机制,动物病毒重组机制有三种:分子内重组:单一分子基因组病毒(DNA或RNA),核酸分子断裂与其他核酸分子再连接.拷贝选择重组:RNA聚合酶选择性地连接到静止模板链上进行RNA子代链的合成.基因重配:发生在分段基因组的RNA病毒.没有核酸分子共价键的破坏,是分段基因组病毒之间核酸片段的交换,基因组各片段在子代病毒中随机分配.,29,2.2.病毒的重组类型,1.活病毒间的重组 2.灭活病毒间的重组 3.死活病毒间的重组,30,2.2.病毒的重组类型,1.活病毒间的重组 例如流感病毒两个亚型之间可基因重组，产生新的杂交株，即具有一个亲代的血凝素和另一亲代的神经氨酸酶。这在探索自然病毒变异原理中具有重要意义。流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒与某些动物(鸡、马、猪)的流感病毒间发生基因重组所致。,31,2.2.病毒的重组类型,2.灭活病毒间的重组 例如用紫外线灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，此称为多重复活(Multiplicity reactivation)。,32,2.2.病毒的复活,3.死活病毒间的重组复活：当灭活（不能复制）病毒与活性病毒同时感染同一细胞由于灭、活病毒之间发生重组，产生了有感染性的重组子代病毒，此现象称复活。,复活,交叉复活,复感 染复活,33,2.2.病毒的复活,交叉复活:一株活性病毒与另一株相关但具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞,由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性重组体.例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的A2亚型流感病毒，可供制作疫苗，此称为交叉复活,34,活病毒与灭活病毒之间（交叉复活）,35,2.2.病毒的复活,复感染复活:基因型相同的几个灭活病毒颗粒感染同一细胞,由于灭活病毒之间发生重组,产生有感染性的重组体子代病毒例如用紫外线灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，此称为多重复活（Multiplicity reactivation），这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组和相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活的危险。,36,3.病毒间的相互作用,3.1.表型混杂 病毒混合感染产生一种具有两个亲代病毒结构蛋白(壳体或囊膜),这种现象称表型混杂.由于表型混杂所产生表型变异个体，因遗传结构并未发生任何改变，故经单代传代都会恢复正常表型。,37,表型混杂,no changes in genomepossibly altered host rangepossibly resistant to antibody neutralization,38,3.1.表型混杂,转壳现象,极端情况,39,40,3.1.表型混杂,无囊膜病毒,亲缘关系近,壳体蛋白发生混杂.有囊膜病毒,一个病毒的壳体包埋在另一病毒囊膜中.,41,42,3.2.病毒间的干扰,发生在同源病毒或亲缘关系近的病毒间.现象：一个病毒在高速繁殖的情况下连续传代,后代病毒颗粒产量相对稳定,但其中感染性病毒产量随着传代数的增加迅速下降,在病毒种群中存在着影响感染性病毒繁殖的干扰.原因：检查发现，种群中有缺失突变体即缺失干扰病毒。实质：缺失干扰病毒通过有效地竞争聚合酶等复制元件而干扰正常病毒的增殖.,43,3.2.病毒间的干扰,病毒间产生干扰的机理可以有四种病毒作用于宿主细胞（病毒寄生的机体），诱导机体产生抑制病毒复制的蛋白质，被称为干扰素；第一种病毒破坏了表面能与病毒结合，让病毒进入的部位，或者改变了宿主细胞的代谢途径，因而阻止了另一种病毒的吸附与穿入（例如粘病毒）；,44,3.2.病毒间的干扰,病毒间产生干扰的机理可以有：阻止第二种病毒遗传信息不能指令病毒蛋白质的制造翻译。这样，另一种病毒的繁殖被干扰。例如，脊髓灰质炎病毒可以通过这种途径干扰水疱性口炎病毒；产生缺陷病毒：这是因为病毒基因组缺少一段特殊的RNA，干扰了病毒的复制，这种缺陷病毒又称缺陷性病毒颗粒（defective inhibition paticle，DIP），能干扰同种的正常病毒在细胞内的复制，如流感病毒在鸡胚尿囊液中连续传代则逐渐增加 DIP，因而发生自身干扰。,45,3.3.缺陷病毒,缺陷病毒:基因组在一个或多个病毒自我复制必需基因上缺乏功能,它的复制需其它病毒基因组或能复制和突变病毒的基因提供辅助活性.整合缺陷基因组:许多动物病毒不能自我复制,需整合到宿主细胞中，它的DNA能引起正常细胞功能发生深刻而持续的变化，利用宿主细胞完成病毒的复制。,46,3.3.缺陷病毒,卫星病毒:是缺陷病毒,它需要与之相关的其它病毒基因产物才能复制.如腺联病毒,必须有腺病毒,才能复制.且其复制可干扰辅助它的腺病毒的复制及腺病毒引起的细胞转化.依赖辅助因子的缺陷干扰病毒(DI):具有三个特征即缺陷性、干扰性、富集性.,47,3.3.缺陷病毒,依赖辅助因子的缺陷干扰病毒(DI):缺陷性：是指DI病毒在必需基因有损伤干扰性：是指DI颗粒干扰标准辅助病毒或其他同源病毒的生长富集性：是指DI颗粒能耗费标准病毒而富集自己,48,3.4互补,是指发生在两种病毒混合感染时，由于一种病毒为另一种病毒提供其必需的但又不能自己合成的基因产物，而促进了增殖；或者两种病毒互为对方提供必需的基因产物，使双方的增殖均有所促进。根据参与病毒的情况，分以下几类:(1)辅助病毒与缺损病毒的互补(2)有活力病毒与灭活病毒互补(3)两株条件致死突变体间的互补(4)病毒内互补 这主要是指多分体病毒内的各个颗粒之间的互补关系。这些颗粒都不能单独感染产生有感染性的子代病毒，而必须同时感染，互为弥补各个颗粒之间的功能缺陷，才能复制产生有感染性的子代多分体病毒。,49,3.5增强,指两种病毒混合培养时，一种病毒能促进增强另一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干扰素所致。,50,病毒变异的实际意义,1.研制减毒活疫苗 如ts株、宿主适应性突变株的研 制。2.应用于基因工程(Genetic engineering)基因工程是将一个生物体的基因(Gene)，也就是携带遗传信息的DNA片段，转移到另一个生物内，与原有生物体的DNA结合，实现遗传性状的转移和重新组合，从而使人们能够定向地控制、干预和改变生物体的变异和遗传。目前病毒基因工程正沿着二个方向发展：一是将编码病毒表面抗原的基因移植到质粒中去，在大肠杆菌中产生大量表面抗原物质，以制备疫苗或诊断用抗原。如乙型肺炎病毒编码表面抗原的DNA片段已在酵母菌中表达，该疫苗正进行人体观察；二是探索病毒作为基因工程载体的可能性，以便将所需要的外源基因带入人体或者物体内，以治疗人类遗传疾病或创造动物新品种的目的。,51,4.哺乳动物病毒表达载体,4.1.瞬时表达病毒载体 来源于裂解性病毒 载体:使一个病毒或细胞基因进入动物细胞的基因运输工具.能引导多拷贝目的基因进入几乎每个培养细胞.瞬时表达载体:当病毒进行裂解性复制时,能够在短时间内表达它们基因的载体.,52,4.1.瞬时表达病毒载体,瞬时表达的病毒载体有:乳多空病毒载体:SV40,优点 对各种突变血凝素基因表达研究具有较高的价值.不足点 外源DNA插入在病毒的必需基因中,所以需要辅助病毒才能复制;SV40包装的DNA分子小(最大为5243bp).,53,4.1.瞬时表达病毒载体,腺病毒载体 优点 能包装大分子量的外源DNA片段(非必须基因可被替代);不需辅助病毒;它能感染哺乳动物的许多组织,包括未分化的细胞,可作为基因治疗的载体.,54,4.1.瞬时表达病毒载体,疱疹病毒载体 优点 导入突变,容易得到疱疹病毒载体;致病力减弱的疱疹病毒突变体仍然能在细胞中复制,并杀死分化细胞,在实验神经系统肿瘤的治疗中具有重要作用;可作为多价疫苗的载体.,55,4.1.瞬时表达病毒载体,痘病毒载体 非常普通的载体 优点 对哺乳动物的异源病毒蛋白能够超表达;痘病毒重组子能够感染多种类型细胞;并在细胞表面上出现与组织亲和性抗原相适应的异源病毒蛋白;痘病毒重组子具有诱导高水平细胞免疫和体液免疫能力.,56,4.1.瞬时表达病毒载体,RNA病毒载体 辛德毕斯病毒:外源基因取代病毒序列,载体为缺陷性重组子.优点 目前载体已构建为非缺陷载体.具有操作容易,成长快速,表达量大,宿主范围广等特点.,57,4.2.稳定表达病毒载体,来源于非裂解性病毒 牛乳头瘤病毒(BPV)和EB病毒 BPV特点:具有环状DNA基因组,它能使细胞致癌性转化,从而提供一个筛选表型.细胞致癌性转化只需部分基因组功能,基因组的其它部分可用目的外源基因等来取代.具有两栖性.缺点:目前还不能包装到病毒中,必须通过转染的方法将其导入细胞.EB病毒与BPV类似.,58,4.2.稳定表达病毒载体,反转录病毒载体 在反转录病毒载体中,外源基因取代编码病毒蛋白的序列,引导反转录和包装的序列保留,载体包含的外源序列限制在10kb以内.它具有转导癌基因的能力,非常适用于癌转化机制的研究.,59,4.2.稳定表达病毒载体,细小病毒载体 细小病毒作为载体进行基因治疗研究受到注意.如腺联病毒(AAV)它能整合到细胞的特异位点,建立一个不显病毒症的慢感染时期.,60,4.2.稳定表达病毒载体,疱疹病毒和腺病毒载体 两者能感染不分裂细胞,在神经生理学基础研究和基因治疗研究方面有潜力.,61,如何利用病毒突变和重组建立病毒生物学研究的有效方法，如何利用重组病毒构建重要疾病基因治疗载体，是研究病毒遗传和变异的主要目的之一。在病毒基因功能研究中，经典的互补试验、克隆基因的互补试验及利用突变和重组进行的顺式因子分析、反式因子分析和基因瞬时表达，都有着不可替代的作用。由于一些病毒可以感染动物和人类的特异组织细胞，利用这些病毒构建表达外源基因载体，用于人类一些特殊疾病的基因治疗，这一方面具有诱人的前景。,