教学课件第二节蛋白质一级结构的测定方法.ppt

第二节 蛋白质一级结构 的测定,一、蛋白质一级结构定义(primary structure)在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包括二硫键的位置。意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础。,蛋白质序列测定的基本战略和步骤,一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列）对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or databank）可以在Altas of Protein Sequence and Structure(.1972-1978,Vols 1-5,Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列 信息都是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。,由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较有名的就是美国National Biomedical Researsh Foundation（国家生物医学研究基金会）主持的PIR（Protein Information Resource，蛋白质信息库或Protein Identification Resouece 蛋白质鉴定库）,美国政府支持的Gene Bank Gene Sequence Data Bank（基因序列数据库），还有欧洲的EMBL（European Molecular Biology Laboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。,PDB(Protein Data Bank):蛋白质结构数据库 PDB 原来有由美国Brookhaven 国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作研究协会（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB）PDB由RCSB 管理。PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库,二、蛋白质一级结构的测定方法,研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构从氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。,但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。,三 测定前的准备工作,测序前的准备工作：蛋白质的纯度鉴定要求：纯度97%以上，均一。鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带，双向电泳。DNSCl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸。(3)亲和层析(4)western 印迹法等,测定蛋白质的分子量,估算氨基酸残基数，确定肽链数 方法：SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法,及测定的一般步骤蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及SS定位等。,蛋白质测序的一般步骤（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。（5）测定多肽链的氨基酸组成。（6）多肽链部分裂解成肽段。（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。（9）确定多肽链中二硫键的位置。,一级结构的测定方法,1.多肽链的分离1）肽链的拆开 蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链，采用的化学处理方法有：,过甲酸氧化,巯基乙醇还原,Clelands试剂的还原作用,稳定SH基的方法：,（A）烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物,稳定SH基的方法：（B）氨乙基化,非共价结合尿素，SDS-PAGE，盐酸胍，高浓度的盐,2）末端分析,（1）N-末端测定 A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB),（1）N-末端测定 B.氰酸盐法异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的氨基发生的反应，生成PTC钛,在弱酸中自发环化转变成PTH衍生物。该试剂称为Edman试剂。由于PTH衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。,（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-肽。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,氨肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,2）末端分析（2）C-末端分析,A.肼解法,无水肼NH2NH2 100 5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产生游离的羧基末端aa。,（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法,羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。,羧肽酶法测C 末端,羧肽酶法,羧肽酶A：除Pro、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）外的所有C端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys,C-末端分析C.C-端氨基酸选择性氚标记法：使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）,还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定氨基醇的类别。,酸水解,常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,-COO+,3）氨基酸组成分析,碱水解,一般用5 mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，1100C煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,酶法裂解,胰蛋白酶（赖氨酸）LysX（精氨酸）Arg X(X Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）（酪氨酸）TyrX（色氨酸）TrpX（苯丙氨酸）PheX(X Pro)嗜热菌蛋白酶 X-Leu（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）胃蛋白酶 Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）X 不能水解Pro羧基参与形成的肽键。Glu蛋白酶 Glu（谷氨酸）XArg蛋白酶 Arg（精氨酸）XLys蛋白酶 XLys（赖氨酸）Pro蛋白酶 ProX,氨基酸的分离和含量测定,氨基酸的颜色反应：,紫色在570nm比色,茚三酮与Pro生成黄色产物，在440nm比色,层析,基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。,氨基酸的分离,色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。,薄膜层析 将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术，但此方法用于定量分析尚不够准确。,氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法,离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。,氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法 若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸-羧基和天冬氨酸的-羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光吸收图谱。,3）氨基酸组成分析,离子交换层析法,离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。,各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸（pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：（1）氨基酸分子所带的电荷；（2）氨基酸分子的极性；（3）氨基酸分子的形状和大小。,3 特殊氨基酸的测定,巯基：SH,Cys（半胱氨酸）特性：弱酸性 pKa=10.28；具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。pKa(电离程度)反应：与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白质失活。与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应，生成的产物在412 nm处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色法测定半胱氨酸的含量。在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。,羟基：Ser（丝氨酸），Thr（苏氨酸），OH 特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。反应：与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶失活。酪氨酸的酚基可与Folin反应的基础，可作为蛋白质定量。为Millon反应的基础。,咪唑基：His（组氨酸）,特性：在生理条件（pH 7）下，组氨酸的咪唑基具有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。pH 6 时，50质子化，pH 7时，90去质子化。也就是说，在生理条件（pH 7）下，组氨酸的咪唑基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。反应：Pauly反应（对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）,胍基：Arg（精氨酸）特性:具有很强的碱性。反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定,甲硫基：Met（甲硫氨酸）,SCH3 特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有14C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素14C标记的甲硫氨酸。,2.多肽链的降解,1）化学法溴化氢法 溴化氰 Met（甲硫氨酸）X,溴化氢化学降解法其优点：,一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段专一性强产率高达80%以上作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可,1）化学法羟胺法,这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解Asn（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。Asn（天冬酰胺）Leu（亮氨酸）Asn（天冬酰胺）Ala（丙氨酸）N-溴代琥珀酰亚胺法 主要裂解Tyr（酪氨酸）处的肽键，五十年代研究较多。但由于它也能断裂Tyr（酪氨酸）His(组氨酸)肽键，因此应用不广。,NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）XCys（半胱氨酸）XCys（半胱氨酸）键的裂解：2硝基5硫氰苯甲酸（NTCB）和2甲基N1苯磺酰 N4（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称Cyssor，专切半胱氨酸）亚碘酰基苯甲酸 Trp（色氨酸）X 产率70-100%,1）化学法（2）部分酸水解法,Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用0.1N盐酸在110或用6N盐酸在37水解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。,优点：专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小。,注意事项：适合酶作用的温度和酸碱度（pH），反应时间。酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液的离子强度等,酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。,2.多肽链的降解 2）酶解法,胰蛋白酶,Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶,Chymotrypsin：（糜蛋白酶）对疏水性氨基酸水解速度比较快。R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。,胃蛋白酶,水解专一性比较广。Pepsin：R1和/或R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快,嗜热菌蛋白酶,中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的肽键。thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,甲硫氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,金黄色葡萄球菌Glu蛋白酶 GluX 谷氨酸羧基端参与形成的肽键。梭菌Arg蛋白酶(clostripain)ArgX 精氨酸羧基端参与形成的肽键。Lys蛋白酶 XLys 赖氨酸氨基端参与形成的肽键。小羊肾Pro蛋白酶 ProX,胰蛋白酶（赖氨酸）LysX，（精氨酸）Arg X(X Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）（酪氨酸）TyrX，（色氨酸）TrpX（苯丙氨酸）PheX(X Pro)嗜热菌蛋白酶 X-Leu（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）,2）酶解法,酶法裂解,胃蛋白酶 Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）X 不能水解Pro羧基参与形成的肽键。Glu蛋白酶 Glu（谷氨酸）XArg蛋白酶 Arg（精氨酸）XLys蛋白酶 XLys（赖氨酸）Pro蛋白酶 ProX,氨基酸的修饰与保护（1）赖氨酸的修饰胰蛋白酶,2）酶解法（1）赖氨酸的修饰 蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解,2）氨基酸的修饰与保护（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶,2）酶解法（3）半胱氨酸的修饰,肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小，造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。,大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用Dowex-50等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽,3 肽段的分离和纯度鉴定,凝胶过滤法,凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱,离子交换层析,固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。,支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE（二乙基胺乙基）和QAE（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。,蛋白质分离纯化（细分级）的方法都可以用。,对角线法：双向电泳和双向层析，第一相电泳后不作任何处理进行第二相电泳，得到对角线图谱说明肽段纯度高。改良对角线技术可以确定二硫键的存在。,高效液相色谱：目前已经成为纯化蛋白质和多肽的有力工具。,层析和电泳游离末端鉴定,纯度鉴定：,4.肽的顺序分析,1）化学法Edman降解法,（一）Edman化学降解法：分析短肽最基本、最有效的方法 Edman试剂：异硫氰酸苯酯（PITC或PTC）降解过程：（1）耦联反应：PITC与肽段N末端氨基酸的氨基（游离）在碱性条件下发生耦联反应，生成PTC肽。（2）断裂反应：在强酸作用下，离PTC肽最近的氨肽键断裂，形成2苯胺5噻唑啉酮衍生物（PTZ）,原来的肽段少一个氨基酸残基。（3）转化（环化）：PTZ不稳定，在酸性条件下，自发环化转变成3苯基2乙内酰脲（PTHAA）。,利用Edman试剂降解一次最多可以测出多少残基，关键在于，肽片段转变为PTC肽及随后的Edman降解反应的产率。一般来说，反应产率逐渐降低。,Edman化学降解的图示,耦联,断裂,转化,1）化学法Edman降解法,PTH氨基酸的鉴定改进 A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。,1）化学法Edman降解法,PTH氨基酸的鉴定改进 B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析超过2000肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。,（二）DNSEdman序列分析法 这是Edman降解的改良技术，此项技术将灵敏度高的DNS分析法和能够连续降解的Edman降解法结合起来。原理如（p 109）所示。用DNSCl（丹磺酰氯）分析鉴定氨基酸的种类，用Edman试剂降解肽段。DNSAA带有荧光，鉴定氨基酸的灵敏度远远高于PTHAA，Edman试剂可以连续降解，而不破坏肽段。缺点是高温，酸性条件下降解，色氨酸被破坏，谷酰胺和天冬酰胺转变成谷氨酸和天冬氨酸,（三）减数Edman序列分析法 这也是Edman降解的改良技术。分析用Edman试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一次丢失的氨基酸就是N末端的氨基酸。优点：快速、准确、样品需要量少。需要有氨基酸自动分析仪。（四）DABITC/PITC双耦联法 DABITC（4N，N二甲氨基偶氮苯4异硫氰酸苯酯）是改进的Edman试剂。N末端的氨基酸从肽段上裂解下来后，生成的颜色明显的DABITHAA。在聚酰胺薄膜上层析分离，盐酸蒸汽熏，显示红色斑点，杂质显蓝紫色。其原理与Edman降解法相同。,（五）酶降解法进行肽段序列分析,1 氨肽酶法：各种氨肽酶的专一性,2 羧肽酶法：,3 二肽酶法：每次切下两个氨基酸残基，进行分析测定。,自动序列分析 蛋白质序列仪（一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定大片断，不适于小肽片段。（二）固相序列仪：用聚苯乙烯作固相载体，近年来用微孔玻璃球，球表面连接丙氨基侧链，在丙氨基侧链后面再连接反应基团与肽片段结合，肽片段的类型（羧基端不同）不同与其连接的反应基团不同。（三）气相序列仪：也称气相固相序列仪。再气态条件下完成Edman降解，反应室内引入携带体polybrene与多肽片段结合，防止样品流失。优点：灵敏度高，效率高，试剂和溶剂消耗量低。,仪器价格昂贵,用自动序列分析仪测序,仪器原理：Edman法。1967液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。1971固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。1981气相测序仪 用Polybrene反应器。（聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97%气相：5pmol 60 肽 98%,Polybrene：Abbott公司商标俗名：hexadimethrine bromide。化学名：1，5dimethyl1，5diazaundecamethylene polymethobromide 1，5二甲基1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物用途：哺乳动物细胞感染，蛋白质自动测序，肝素拮抗剂。,四 由已知序列肽段建立蛋白质一级结构,重叠肽：分子量较大的肽段，通过多种方式的专一性切割，分析小肽段的氨基酸排列顺序。1多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。2 测定每个肽段的氨基酸顺序。3 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,肽的顺序分析2）酶解法肽谱重迭法,分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。,分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。,4.肽的顺序分析2）酶解法肽谱重迭法,4.肽的顺序分析2）酶解法肽谱重迭法,AlaPhe+GlyLysAsnTyr+ArgTrp+HisVal糜蛋白酶水解+肽(AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal)胰蛋白酶水解AlaPheGlyLys+AsaTyrArg+TrpHisVal,5.二硫键定位,含二硫键肽的检出方法 1）凝胶过滤或离子交换层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。,5.二硫键定位 2）对角线电泳或层析,将水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。在第二相电泳中，那些不含-S-S-的肽的情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。,对角线电泳法碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化SS生成-SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置,酰胺的确定,Asp Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn，Glu还是Gln。Leu-Glx-Pro-Val肽 在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+Pro0 Val-此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。,蛋白质一级结构的测定的新方法和新思路,X衍射法测定一级结构；分离相应蛋白质的mRNA，由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定，使人们掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。,Thanks for your attention,