微生物的纯培养和显微摄影技术.ppt

第二章 微生物的纯培养和显微技术,微生物的分离和纯培养,显微镜和显微技术,本 讲 结 束,本 讲 结 束,培养物,在微生物学中，在人为条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture)。,纯培养物,只有一种微生物的培养物称为纯培养物，又称纯培养（pure culture),如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养.,在进行菌种鉴定及生产应用时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化,一、无菌技术,二、用固体培养基分离纯培养,三、用液体培养基分离纯培养,四、单细胞（单孢子）分离,五、选择培养分离,六、二元培养物,七、微生物的保藏技术,返回,在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术（aseptic technique),一、无菌技术,1、微生物培养的常用器具及灭菌,2、接种操作,将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种,1.接种针 2.接种环 3.接种钩,（1）接种工具,4.5.玻璃涂棒,6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,（2）接种方法,A、划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。,B、三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的,C、穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长,D、混浇接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落,E、涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。,F、液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种,G、注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病,H、活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。,(3)无菌操作,培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作,实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。,空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上,(1)接种灭菌,(2)开启棉塞,(3)管口灭菌,(4)挑起菌苔,(5)接种,(6)塞好棉塞,然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。,菌落单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落,菌苔但固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。,平板熔化的固体培养基到入无菌平皿，冷却后，盛有固体培养基的平皿。,1、稀释倒平皿法,2、涂布平板法,3、平板划线分离法,4、稀释摇管法,返回,1、稀释倒平皿法,首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。,2、涂布平板法,首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。,3、平板划线分离法,最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落,1、利用选择培养基进行直接分离,通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。,2、富集培养,富集培养创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物，从而使其在群落中的数量大大增加。,如果培养物中只有两种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。是保存病毒的最有效的途径,大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹森（Zaccharias Janssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身。（单式显微镜）,詹森制造的是第一台复合式显微镜。使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的的放大倍数就是10*20=200倍,胡克的显微镜,詹森时代的复合式显微镜并没有真正显示出它的威力，它们的放大倍数低得可怜。荷兰人安东尼冯列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek，1632-1723)制造的显微镜让人们大开眼界,列文虎克自幼学习磨制眼镜片的技术，热衷于制造显微镜。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍，超过了以往任何一种显微镜,列文虎克没有发明第一个复合式显微镜，他的成就是制造出了高质量的凸透镜镜头。,在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善，例如人们发明了能够消除色差（当不同波长的光线通过透镜的时候，它们折射的方向略有不同，这导致了成像质量的下降）和其他光学误差的透镜组,最经典的复式显微镜:Zeiss实验室显微镜这种显微镜与我们今天所使用的一些普通显微镜一模一样.事实上,我们现在所使用的一些普通型显微镜的结构都是以它为模板的，由于这种显微镜性能好,价格低廉(在中国都只卖400多元,而好的显微镜的价格都在几千到几万元),所以在一上市的时候就得到了人的青睐,很快占领了各大实验室和医院等地方.成为至今为止最畅销的复式显微镜,为科学的发展作出了巨大贡献.,与19世纪的显微镜相比，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因很简单：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。,人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.180.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来,色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在象方则可能形成一个色斑,显微镜的重要光学技术参数,显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准,一 数值孔径（NA)(Numerical aperture),数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上,NA=n sin(u/2),n是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率,u是孔径角又称“镜口角,是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比,数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限,数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小,二 分辨率,辨率又称“鉴别率”，“解想力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。,d=0.5/NA,要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施1 降低波长值，使用短波长光源。2曾大介质n值3增大孔径角。,光学显微镜在使用最短波长的可见光（450nm)作为光源，在油镜下可以达到的最大分辨率是0.18m,光学显微镜的放大倍数只能达到10001500倍,三 放大率放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。,四 焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：1焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。2焦深大，分辨率降低。,五 视场直径（Field of view）观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。F=FN/MobF:视场直径，FN：视场数，Mob:物镜放大率。,视场数（Field Number,简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出：1 视场直径与视场数成正比。2 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。OLYMPUS SWH 目镜的视场数可达26.5,目前是世界上最大的,六 覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.160.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标科的确0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。,七 工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,各种显微镜镜检介绍,一 明视野观察（Bright field）明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。,二 暗视野观察（Dark field）暗视野实际是暗场照明。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的象。,暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。,暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。,三相衬镜检法（Phase contrast）在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本.相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求：1 环状光阑（Ring slit）:装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体-相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。2 相差板（Phase plate）:装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面；另一是通过衍射光的部分，叫“补偿面”。有相板的物镜称“相衬物镜”，外壳上常有“Ph”字样。,五 荧光镜检术荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察,六、透射电子显微镜,分辨率0.34nm,扫描电子显微镜,扫描隧道显微镜,显微镜的结构与使用,一、显微镜的结构光学显微镜（以下简称为显微镜），是用来观察肉眼看不见的微小生物结构的。一架显徽镜包括光学系统和机械装置两大部分，现分述如下：,（一）机械部分1镜筒镜筒是一个金属长筒，筒口上端安装目镜镜头，下端装有镜头转换器和物镜头2镜头转换器它是安装在镜筒下端的一个旋转圆盘。镜头转换器上有3或4个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。,3粗准焦螺旋位于镜臂的上方，可以转动，以便使镜简能上下移动，从而调节焦距。4细准焦螺旋位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距,5镜座是位于镜臂下方、呈马蹄形的金属座，用以稳固和支持镜身。6镜柱上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。7镜臂上接镜筒，下连镜柱，呈弓曲形。它是显微镜上的手握之处。,8倾斜关节位于镜柱和镜臂连接处的活动关节，可用于调节镜臂的倾斜度，便于观察。9载物台是放置玻片的平台。其中央具有通光孔，在通光孔的左右各有一个弹性的金属压片夹，压片夹是用来压住载玻片的夹子。,（二）光学部分1目镜它是插在镜简顶部的镜头，是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如5X、10X、15X、20X。2物镜它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，例如10X、40X、60X等。显徽镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数。,3反光镜它在聚光器的下方，有平面和凹面两种镜面，两面反射光线的强度不同。平面镜反射平行光线，它的反射强度较凹面镜弱。人们可以按需要翻转反光镜。,4聚光器是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线。在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。,5虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成，在较高级显微镜上具有此装置。使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上袋有滤光片，可调节光源的色调。,二、显微镜的使用规程（一）实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm左右。（二）转动转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台12cm左右处，然后用左眼注视目镜内，接着用手将反光镜转向光源，把虹彩光圈调至最大，使光线通过反光镜和聚光器反射到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。（三）将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央，然后用压片夹压好载玻片。,（四）先用低倍镜观察（物镜10X、目镜10 x）。观察之前，先转动粗准焦螺旋，使镜筒下降，使物镜逐渐接近切片。需要注意，不能使物镜触及玻片，以防镜头将玻片压碎。然后，左眼注视目镜内，同时右眼不要闭合（要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯，以便在观察的同时能用右眼看着绘图），并转动粗准焦螺旋，使镜筒慢慢上升，不久即可看到玻片中材料的放大物像。（五）如果在视野内看到的物像不符合实验要求（物像偏离视野），可慢慢移动玻片。移动时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以调节细准焦螺旋，直至物像清晰为止。,（六）如果进一步使用高倍物镜观察，应在转换高倍物镜之前，把物像中需要放大观察的部分移至视野中央（将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，视野中的物像范围缩小了很多）。一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰，可以转动细准焦螺旋进行调节。,分辨率,二十世纪的显微科学,倒置显微镜,偏振光显微镜,荧光显微镜,相差显微镜,微分干涉显微镜,电子显微镜以及最先进的共焦激光扫描显微镜(CLSM)和扫描隧道电子显微镜(STM).人们采用这些先进的技术相继发现了细胞的各种精细结构如细胞骨架,遗传物质RNA,DNA.各种病毒粒子和蛋白质分子也被人们看到.,1982年,扫描隧道电子显微镜被发明,这种显微镜具有极高的分辨率(0.1埃即百亿分之一米),人们用它第一次看到了原子;1989年人们又用它拍到了清晰的DNA的照片.,