微生物的培养.ppt

考试说明要求,微 生 物 的 利 用,什么是微生物？,生物:动物界,植物界,微生物界.微生物：形体极小，结构简单，只有在光学显微镜和电子显微镜下才能看清楚的生物,微生物的类群,3真菌界(单或多C)：例如酵母菌、霉菌、真菌4原生生物界(单C)：例如草履虫、变形虫,非细胞结构,1病毒：例如艾滋病毒、朊病毒,细胞结构,原核细胞:,2原核生物界(单C)：细菌、蓝藻、放线菌、支原体,真核细胞:,一、细菌,1、细菌的结构,细菌的结构,细胞壁细胞膜细胞质：核糖体（唯一细胞器）质粒（非细胞器）：含抗药性基因，抗生素合 成基因，固氮基因拟核：大型环状DNA反复折叠特殊结构：菌毛，鞭毛，荚膜等,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,休眠体，为抵抗逆境,一、细菌,2、细菌的繁殖：,细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖,细菌的外形与大小,细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,几种菌落,二、放线菌,单细胞原核生物,二、放线菌,2、放线菌的结构 单细胞原核生物,培养基,二、放线菌,3、放线菌的分布放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。4、放线菌的繁殖 无性孢子形式进行无性繁殖,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,5 应用:,三 病毒,病毒的结构,基本结构：1 蛋白质 2 核酸：DNA或RNA特殊结构：囊膜（多糖）刺突（流感病毒有）等,三、病毒,2、病毒的繁殖（增殖）,吸附,培养基的种类,按照物理性质划分培养基,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,主要用于微生物的分离、鉴定等,主要用于观察微生物的运动、保藏菌种等,主要用于工业生产实验室扩大培养菌种,需加入凝固剂，如琼脂,培养基种类,根据物理状态分 固体培养基：用于微生物的分离，鉴定。纯化，增菌 半固体培养基：用于观察微生物的运动，保种 液体培养基：用于工业化生产 增菌,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),(是否运动),按照化学成分划分培养基 天然培养基：化学成分不明确，玉米粉，牛肉膏，蛋白胨等用于工业化生产合成培养基化学成分已知，含量精确。用于实验室研究,按照培养基的用途划分培养基,选择培养基：加入（或减少）某种化学物质，抑制不需要的微生物的生长，促进需要微生物的生长。如：酵母菌细菌加入青霉素后，只有酵母菌生长，细菌死亡。鉴别培养基：加入某种化学物质，呈现不同的颜色或状态。如：伊红美蓝加入后，大肠杆菌呈紫色，金属光泽。其他细菌则无此现象。,下列培养基属于哪种培养基？,蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25g氯化钠：0.5g水：50 ml琼脂：1g,天然培养基，固体培养基,加入伊红美蓝后，鉴别培养基,LB培养基,微生物的营养,水无机盐 碳源氮源生长因子,氧气、pH等,基本营养要素,碳 源,概念：凡是能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质，就叫做碳源 来源：无机碳源：CO2、NaHCO3有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油最常用碳源：糖类是最常用的碳源，尤其是葡萄糖功能：构成微生物的细胞物质和代谢产物 异养微生物的主要能源物质,以碳源分,自养型：以无机物为碳源；异养型：以有机物为碳源。,概念：凡是能为微生物提供所需氮元素的营养物质，就叫做氮源 来源无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐有机氮源：尿素、牛肉膏和蛋白胨 最常用氮源：铵盐、硝酸盐功能：用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物。对于异养微生物来说，含C、H、O、N的化 合物既是碳源，又是氮源。,氮 源,1.哪种细菌培养时不用在培养基中加氮源呢？,思 考,固氮菌,2.对于硝化细菌来说，氨的功能有哪些？培养基中可以不添加哪种成分？,既是氮源，也是能源物质可以不添加碳源,判断题（1）同一种物质不可能既作碳源又作氮源。（2）凡是碳源都能提供能量。（3）除水以外的无机物仅提供无机盐（4）无机氮源也能提供能量。,并非任何一种微生物都需从外界吸收。如生长因子自养型微生物，包括真菌和少数细菌（大肠杆菌）等，均不需要外界提供生长因子；异养型微生物则需要补充多种生长因子，如乳酸菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等。,生长因子,定义:它是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。,主要包括：维生素 氨基酸 碱基,来源：酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液,功能：酶和核酸的组成成分,加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加入伊红-美蓝的培养基 鉴别大肠杆菌分离能分解尿素的微生物（纤维素）尿素为唯一氮源的培养基（纤维素）（碳源）,讲练测P173 例1（1）、（5）P175 1、3、4,大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的细菌。,将细菌分成两大类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。,与细胞壁的成分有关,大肠杆菌的培养与分离,实验内容：先用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，再用LB固体培养基划线法分离，形成单菌落。,接种环,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,实验：微生物的实验室培养,（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）“细菌喜荤，霉菌喜素”（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）pH：细菌偏碱，真菌偏酸（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）生产：天然。分类鉴定：合成培养基,一 培养基的配制,原则,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。,二 灭菌,（）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三种方式。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、氯气，4、紫外线消毒：,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)灭菌的方法：,玻璃砂漏斗,4.过滤灭菌法(不能加热的物质),尿素，抗生素等,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。,下列物体的灭菌消毒方法：,培养基：三角瓶，量筒，培养皿：接种环，涂布器：双手：牛奶：饮用水：维生素：,高压蒸汽灭菌,高压蒸汽灭菌，干热灭菌,灼烧灭菌,巴氏消毒,化学消毒：酒精,化学消毒：氯水,过滤灭菌,超净台上紫外灯和过滤风,讲练测P172 无菌技术具体操作,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,三 培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）,倒入三角瓶和试管,（漏斗法）,一些注意事项：,1、棉花的使用,不能用脱脂棉，易吸水。,棉花塞的制作,不能过松，也不能过紧,实验1 大肠杆菌的培养和分离,实验1 大肠杆菌的培养和分离,搁置固体斜面培养基,固体培养基倒入培养皿中（倒平板）,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,四 微生物的接种,目的不同，接种到不同培养基中。目的1，大肠杆菌扩大培养目的2，短期保存菌种目的3，分离单个大肠杆菌,接种到装有液体培养基的三角瓶中,接种到装有固体培养基的培养皿（平板）上,接种到固体斜面培养基上,接种,用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，并使斜面向上成水平状态。右手拧松棉塞，但不要取下。,接种,右手拿接种环（如握钢笔），在火焰上烧灼灭菌。注意：有可能伸入试管内的接种环其余部分也要烧灼，特别是箍处。,接种,在火焰边用右手无名指和小指夹住两个棉塞，将它们取下（不能放下）。同时左腕转动，烧灼管口一周，勿烧得过烫。注意：不要将酒精灯碰翻，以免烧伤。,接种,将接种环伸入试管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。然后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。,接种,在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部，由里向外轻轻画蛇形细线，线要画密一些。注意不要将培养基画破，也不要使接种环接触到管壁或管口。,接种,抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。将接种环在火焰上烧红灭菌，接种致病菌时更要注意这点。将棉塞旋紧。注意：棉塞与火焰的距离要适当，以免棉塞燃烧。,分离纯化大肠杆菌的方法,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,微生物的恒温培养,五 微生物的恒温培养,固体培养基：菌落,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：-20甘油冷冻管藏法,微生物实验室培养的基本操作程序,1、培养基的配制2、灭菌3、培养基的分装（倒平板）4、微生物接种5、恒温箱中培养,