微生物基因工程第六.ppt
第六章 外源基因的表达（三）,6.1 基因表达的机制6.2 基因表达的调控元件6.3 影响外源基因表达的因素6.4 外源蛋白的融合表达及分泌表达6.5 大肠杆菌基因表达系统 6.6 酵母基因表达系统6.7 哺乳动物基因表达系统6.8 外源基因表达产物的分离纯化与检测,8 外源基因表达产物的分离纯化,A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则B 离子交换层析C 凝胶层析D 亲和层析E 膜分离F 原核生物表达的重组蛋白质量检测,A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4 mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉,分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,B 离子交换层析,离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的基本性能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变ppH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的分类 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离 可电离的基团 伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3）叔胺基（-N(CH3)2 季胺基（-N+(CH3)3,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的分类强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂离子交换树脂：最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexG）Sephadex的优点如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的 Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose（阴离子型）和 CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小因此具有稳定的外形体积。,离子交换介质的选择原则,一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离碱性物质用阳离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高 交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,C 凝胶过滤层析,凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温。Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。,凝胶介质的基本性质,琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排阻限度。当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。,凝胶介质的基本性质,聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）,凝胶介质的选用原则,组别分离 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4,凝胶介质的选用原则,分级分离 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离,该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,凝胶层析的基本操作,层析柱平衡 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件,凝胶层析的基本操作,进样体积上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好,D 亲和层析,亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作,亲和层析的基本概念,亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制,亲和层析的基本概念,具有特异性亲和作用的生物分子抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和层析的基本概念,亲和层析的基本原理亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来,亲和层析载体的性质与选择,亲和层析载体的选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性,亲和层析载体的性质与选择,常用的亲和层析载体纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体,亲和层析配基的性质与选择,亲和层析配基的选择纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力,亲和层析配基的性质与选择,配基的偶联酸酐法N-取代羟基琥珀酰亚胺法叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,亲和层析的基本操作,非专一性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低,亲和层析的基本操作,专一性洗脱使用特异的配基作为洗脱剂使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物,亲和层析的基本操作,特殊性洗脱 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法。,E 膜分离,膜分离的基本原理分离膜的主要性能影响膜分离的因素,膜分离的基本原理,膜分离的基本定义 膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的。,膜分离的基本原理,膜分离的特点分子级别的分离过程，分离效率高不涉及相变，能耗低，运行成本低膜分离为单纯物理变化，无二次污染,膜分离的基本原理,膜分离过程的重要参数分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差,膜分离的基本原理,膜分离的主要类型 根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可分成下列几类：透析（Dialysis DS）反渗透（Reverse osmosis RO）超滤（Uitrfiltration UF）微滤（Microfitration MF）电渗析（Electrodialysis EI）,膜分离的基本原理,膜分离的主要类型透析（Dialysis DS）透析过程使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理想的半透膜。当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓度）一侧流动，这种现象叫渗透。,膜分离的基本原理,膜分离的主要类型反渗透（Reverse osmosis RO）反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、苦咸水淡化和产纯水制备等方面,膜分离的基本原理,膜分离的主要类型超滤（Uitrfiltration UF）超滤是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1nm-0.1m，相应的截留分子量范围从500到100万左右。,分离膜的基本性能,膜的化学物理性能 分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过性能和化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性能、毒性、机械强度等。,分离膜的基本性能,膜的分类按膜的孔径大小分类：微滤膜 0.025-14m超滤膜 0.001-0.02m反渗透膜 0.0001-0.001m纳米过滤膜平均孔径 2nm,分离膜的基本性能,膜的分类按膜的结构分类：对称性膜 膜截面上的孔道结构均匀 传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗不对称性膜 由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成 传质阻力小，透过通量高，被广泛使用,分离膜的基本性能,膜的分类按膜的材料分类：天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素 将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：管式、板式、螺旋圈式、中空纤维（毛细管）,影响膜分离的因素,影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：溶质在膜孔内吸附溶质在膜表面沉淀或结晶造成膜污染的主要原因是：蛋白质在不同pH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜,F 原核生物表达的重组蛋白质量检测,工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。重组蛋白的质量控制指标包括：重组蛋白的鉴别（序列）重组蛋白的纯度（杂质的类型）重组蛋白的活性（检测方法）重组蛋白的安全性重组蛋白的稳定性重组蛋白的一致性（构象与构型）,
