第三章细胞工程.ppt
第三章 细胞工程,一、细胞工程原理与技术,细胞工程（cell engineering）：是应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，在细胞或细胞器水平上改变细胞内的遗传物质，已达到改良品种、创造新品种、加快繁殖动植物和微生物个体以及获得其代谢产生特种细胞产品的一门综合性生物工程技术。主要包括细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作和转基因生物、细胞代谢物的生产和生物克隆,70年代末，德国科学家米尔赫(G.Melehers)等成功地把两种不同的植物马铃薯和西红柿的体细胞融合在一起，获得具有以上两种植物遗传特性的新品种。融合后的杂种细胞不仅能分裂，而且能分化，发育成一株完整的植株。新品种的问世，这一成就的意义是巨大的，无疑是对大自然的挑战。,图中的“白菜甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易于贮存等优点。,无菌操作细胞培养细胞融合细胞拆合,细胞工程基本技术,无菌操作,无菌操作技术是保证细胞成功培养的基本条件,无菌室、超净台器具、培养基生物材料试验人员,细胞培养,定义：动植物和微生物细胞在体外无菌条件下，在适宜的培养环境和人工配制的培养基中进行生长、分裂和繁殖 温度、湿度、pH、光照、氧气、二氧化碳,细胞融合,又称体细胞杂交（somatic hybridization）或细胞杂交（cell hybridization），是指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的品种细胞或同种生物不同类型细胞或原生质相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合形成杂种细胞的现象。,异核体 杂种细胞,细胞融合步骤,细胞标记 抗药性、营养缺陷型、温度敏感型、紫外敏感型制备原生质 植物和微生物诱导细胞融合 同种细胞可自发融合，异种细胞须诱导筛选杂合细胞 须在融合体再生后，进行几代的自然分离、选择,细胞拆合,通过物理或化学方法将细胞核质分开，然后将不同来源的细胞质与细胞核重新组合，重建成核质杂交细胞。多利羊,1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,二、动物细胞工程及其应用,2、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养:指从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,“人耳鼠”争议,2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这只小白鼠背上背着一只“人类耳朵”。这是曹谊林利用组织工程技术复制出来的。,2011年中国工程院院士增选进入第二轮评审，国内组织工程领域“头号人物”曹谊林，却被“学术造假”的质疑推上风头浪尖。质疑者称，曹谊林赖以成名的“人耳鼠”是维持了十余年的谎言。,（一）细胞培养设施无菌操作室 培养与观察室制备区域储藏区域清洗与灭菌区域,（二）细胞的培养,平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖组成，起维持细胞渗透压、调节pH、供给细胞所需能量和无机盐，主要用于合成培养基的基础液和洗涤细胞、组织 Hanks PBS D-Hanks 消化液 分散消化细胞pH调整液 抗生素 低水平微生物污染 青链霉素谷氨酰胺补充液 细胞代谢,培养基天然培养基 来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、组织和胚胎浸出液 成分复杂、批次间差异大、易污染、制备过程繁琐,合成培养基 基本培养基 模拟细胞在体内生存生长的环境条件，设计出类似体外环境而适宜细胞在体外生存的各种培养基，主要成分包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等，添加血清后称为“完全培养基”无血清培养基 不添加血清即可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，含基础培养基和添加组分 添加组分：帮助细胞附着和贴壁的胞外基质 细胞生长代谢所需营养成分 促细胞生长增殖的生长因子 酶抑制剂,环境因素 无污染 无毒无菌 温度 温度不超过39时，细胞代谢强度和温度成正比 pH 多数哺乳动物最适pH为7.2-7.4 气体 O2、CO2 渗透压 过高或过低会使细胞皱缩、肿胀或破裂,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,动物细胞培养过程,（分解弹性纤维）,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,取材 组织细胞的分离 原代培养传代培养纯化冻存和复苏,细胞融合是正常的生命活动,受精作用,（三）动物细胞融合,显微镜下细胞融合的过程,通过施加化学、生物或物理等诱导细胞融合的因素，提高不同基因型细胞的融合频率并使之形成单核杂种细胞,单个细胞制备,融合细胞筛选,互补法鉴定 营养缺陷、抗性细胞学鉴定 荧光标记生化分析鉴定 基因产物、次生代谢物分子生物学鉴定,荧光标记示意图,动物细胞融合（总结）,2.诱导融合的方法：,1.自然条件下的细胞融合现象,3.融合的具体过程：,先是细胞质融合，细胞核的融合是在第一次有丝分裂时完成的。,（四）干细胞工程技术,干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，具有再生为组织、器官的潜能,（五）胚胎工程技术,主要是针对哺乳动物的胚胎进行人为的工程操作，然后让其继续发育，获得人们所需要的成体动物 胚胎移植 胚胎冷冻 体外受精 克隆动物 性别控制,预想一下，克隆人技术路线？,三、植物细胞工程,在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、原生质体等进行离体培养，使其按照人们的设计，定向长成完整的植株，已达到改良品种或创造新物种，或获得有用物质的过程,植物细胞工程的核心：利用细胞全能性，人为定向调控细胞生长,细胞全能性：一个活细胞具有发育成一个完整个体的潜能1902年，G.Haberlandt首次提出1958年，Steward 将胡萝卜韧皮细胞培养出植株,植物细胞培养,培养基环境技术,培养基无机营养成分：大量元素 N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素 Fe、B、Mn、Cu、Mo、Zn、Co有机营养成分：含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2-5%的蔗糖溶液，调节渗透压 维生素：VB1、VB6、烟酸、也算、泛酸、生物素 激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 天然有机添加物：椰汁、番茄汁等，促进细胞和组织增殖分化琼脂 起支持作用,培养基种类,MS培养基 无机盐浓度较高，使用广泛B5培养基 铵浓度低，适合双子叶尤其是木本植物White培养基 无机盐浓度低，适于生根N6培养基 成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高Nitsch培养基 在MS培养基基础上改进,培养基的配制,先配成母液，使用时稀释注意防止产生沉淀铁盐要单独配制大量元素、微量元素、铁盐、有机物,环境条件 温度 大多数植物组培温度为23-28 湿度 湿度过低使培养基丧失水分，湿度过高易污染 光照 愈伤增殖期黑暗或弱光培养；分化阶段需要光照 渗透压 0.1-0.2 MPa 气体 pH 5.8-6.2,培养技术 1、无菌外植体的获得 外植体：植物组培中用来进行无菌培养的离体材料 2、外植体接种 将无菌外植体移至培养基上进行培养,愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种排列疏松无规则、高度液泡化、无定形态的薄壁细胞组成的组织。,离体的植物器官、组织或细胞,脱分化（又叫去分化）,愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）,再分化,根或芽等器官,植物体,植物组织培养的基本过程,切取形成层,诱导愈伤组织的形成,试管苗的形成,培养室,移栽,脱分化,再分化,无菌接种,叶片接种到培养基上,产生愈伤组织,愈伤组织增殖,愈伤组织开始分化,愈伤组织分化出芽,培养基中的试管苗,植物组织培养过程示意图,植物细胞融合技术,原生质分离原生质纯化原生质活力测定,去壁,原生质的分离,机械法酶促法,原生质的纯化,植物材料经处理后，混合液中除了完整、未损伤的原生质，还包含未去壁的细胞、破碎的原生质、细胞器等，需要去除杂质获得完整原生质过滤离心漂浮,原生质的活力测定,形态识别 形态、渗透压相差显微镜观察 细胞质流动、细胞核荧光显微镜法（FDA法）活细胞发出黄绿色荧光 FDA：荧光素二乙酸酯酚藏花红染色法 死细胞染色伊凡蓝染色法 死细胞染色,植物体细胞杂交应用研究,植物细胞器移植,植物细胞器移植是指：从不同植物细胞中分离得到细胞器，再将其导入受体原生质中的过程。原生质摄取细胞器的机制：内吞 融合 脂质体包装后融合,细胞器分离 机械法 匀浆 过滤 离心 从原生质体中分离细胞器摄入 夹层离心法 PEG诱导法 脂质体包装,细胞器移植概况,细胞核移植叶绿体移植：1973年 卡尔逊 白化烟草原生质与烟草的叶绿体混合绿色烟草 叶绿体+鸡卵细胞混合鸡卵细胞成活7d线粒体移植细胞重建 在融合因子介导下，使细胞质体与完整细胞合并，构成核质杂种,植物染色体工程,染色体加倍技术单倍体育种染色体非整倍改造,染色体加倍,同源多倍体较二倍体形态更大，代谢活动增强秋水仙素 破坏纺锤丝形成,1.人工诱导植物多倍体的意义,多倍体(polyploidy):植物的性状比原来的二倍体气孔、花、果实和种子比二倍体者为大，叶肉较厚，茎秆也较粗壮,三倍体无子西瓜的培育过程,单倍体育种,单倍体只有一套染色体，每个基因都能显示相应的性状，易发现新产生的突变，可用于研究基因功能及基因剂量效应获得纯合二倍体 花药培养花粉培养异源种属花粉诱导,植物单倍体育种:由于单倍体只有一套染色体，染色体上的每个基因都能显示相应的性状，所以极易发现所产生的突变，尤其是隐性突变，在表型上可以直接表现出来，所以单倍体是研究基因或基因效应、进行染色体遗传分析的理想实验材料1）克服杂种分离，缩短杂交育种年限2）排除显、隐性基因干扰，提高选择效率3）单倍体是诱变育种的良好材料4）能克服远缘杂交的不孕性，创造生物新类型5）利用单倍体对栽培品种进行纯化,3、单倍体育种的优越性,花药培养 花粉、药隔、药壁、花丝,花粉培养 将花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养选择合适的培养基、严格控制培养条件,异源种属花粉诱导 亲缘关系较远的花粉不易使母本卵细胞受精，又能刺激卵细胞单性发育，由此产生单倍体玉米、野生稻给普通水稻授粉白菜型油菜给甘蓝型油菜授粉,其它植物细胞工程技术,胚胎培养快速繁殖脱毒技术细胞悬浮培养,胚胎培养,植物胚胎培养是指在离体条件下使胚或具胚器官发育成幼苗的培养技术胚培养 缩短育种周期胚乳培养 培养三倍体植株胚珠子房培养 克服远缘杂交败育,快速无性繁殖利用离体培养技术，将优良植株的器官、组织、细胞进行立体培养，短期内获得大量遗传性状一致的个体,无性快繁步骤：无菌母株获得不定芽增殖完整植株形成再生植株训化再生植株鉴定,试管苗大规模培养,培育脱毒作物微茎尖培养珠心组织培养热处理,悬浮培养,将细胞或小块愈伤组织在无菌培养液中进行体外生长、发育能产生大量均一细胞，增殖速度快,植物组织培养大量生产紫草素,现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功，但由于成本较高，中国尚未应用于生产。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,请问：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。,眼虫（含叶绿体）,三、微生物细胞工程及应用,应用微生物细胞进行细胞水平的研究和生产包括微生物细胞的培养、遗传性状的改变、微生物细胞的直接利用、微生物代谢产物的获取,微生物细胞融合,早在1958年，冈田善雄发现，用紫外线灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。1976年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等真菌种间原生质体融合也获得成功。,微生物细胞融合工艺,影响微生物细胞融合的因素,一、菌株的遗传性状 需要有选择标记，标记主要通过诱变获得 需先测定各个标记的自发回复突变率，若回复突变率过高，则不宜作为选择标记二、制备原生质体的菌龄 对数期细胞的细胞壁中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。,三、细胞的前处理 细胞壁结构的差异,细菌G+溶菌酶去壁G-EDTA+溶菌酶、EDTA+溶菌酶+Gly,真菌 蜗牛酶，是多酶体系，含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、几丁质酶、-淀粉酶、酯酶,生产蛋白质药物 白介素、干扰素、胰岛素生产限制性内切酶 生防菌 哈茨木霉菌T-22株系生物肥料 固氮菌植物激素 赤霉素环境治理 二噁英、海洋浮油含糖废液的利用 酵母木质纤维的利用 白腐真菌采矿 氧化亚铁硫杆菌,微生物细胞工程的应用,四、细胞工程在食品工业上的应用,动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程,四、细胞工程在食品工业上的应用,动物细胞工程 培育食用肉、动物育种、单克隆抗体,植物细胞工程,食品添加剂：甜味剂、鲜味剂、防腐剂、色素香料：香草素、可可香素、菠萝风味剂抗氧化剂：-生育酚天然食品：食用琼脂植物药：人参皂苷、迷迭香酸、小檗碱,微生物细胞工程 酵母菌的育种 酿酒酵母+克鲁维酵母，生产啤酒 氨基酸生产菌育种 谷氨酸生产菌 酶制剂生产菌 芽孢杆菌,谷氨酸棒杆菌,酵母,芽孢杆菌,
