实验细胞骨架的观察.ppt

实验六 细胞骨架的观察,一、考马斯亮兰R250染色法,【实验目的】掌握用考马斯亮蓝R250（Coomassie blue R250）染色法观察植物细胞骨架的方法。,【实验原理】,细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。,【实验原理】,细胞骨架(Cytoskeleton)组成：主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维则分布在整个细胞中。细胞骨架作用：具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。细胞骨架的研究方法：考马斯亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。,考马斯亮兰R250染色法的原理：考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性，即用非离子去垢剂（如Triton X-100）处理时，可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时，细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能清晰地显示微丝束的形态。,Triton X-100,SDS,实验器材、材料和试剂,光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片；新鲜洋葱;,6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）、M缓冲液、1%Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。,3%戊二醛用PBS配制,实验步骤,1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于35ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1)；对照无PBS处理；2、用35ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯2)；对照无1%Triton X-100的M缓冲液处理20min;3、吸去Triton X-100，用M缓冲液35ml洗2次，每次5 min(烧杯3)；对照无M缓冲液处理;4、35ml 3%戊二醛固定20 min(烧杯4)；5、pH6.8磷酸缓冲液35ml洗2次，每次5 min，滤纸吸去残液(烧杯1)；6、35ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15和30分钟，然后用蒸馏水小心冲洗12次(烧杯5)；做染色时间的影响；7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显微镜或者油镜下进行观察。,细 胞 骨 架,洋葱表皮细胞骨架,