实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法.ppt
实验 琼脂糖凝胶电泳一 原理二 目的 掌握核酸电泳的方法。三 材料 质粒DNA 四 步骤,1、带电荷的物质在电场中趋向运动称为电泳。与蛋白质分子相似，核酸分子也是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动，在时，碱基几乎不解离，磷酸根全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同。在自由泳动时各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。,2、指示剂与染色剂 溴酚兰 二甲苯青 溴化乙锭3、上样缓冲液（loading buffer,6*,10*)0.25%溴酚兰 0.25%二甲苯青 30%甘油,溴化乙锭(Ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来自两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后将能量传给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发射的荧光强度大10倍，因此不需要洗净背景就可以清楚地观察到核酸的电泳条带，若核酸量少，而EB的背景太深致使带型不清，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1小时或10mmol/LMgCl2中5min,使非结合的EB褪色，减少未结合的EB产生的背景荧光，这样可以检测到10ng的DNA样品。单链DNA,RNA分子中常存在自身配对的双链区，也可嵌入EB分子，但嵌入量少，因而荧光较低，其最低检出量为0.1ug.,本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可上样电泳。本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5%1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5TBE中)，而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不同。本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳带清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制品。,(DNA用),本制品是核酸电泳用Loading Buffer。制品中含有SDS，可即刻停止各种酶促反应。使用时向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可上样电泳。本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5%1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5TBE中)。本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，特别适用于各种酶促反应的停止以及各种酶促反应后的琼脂糖凝胶电泳。一般来说，各种限制酶、修饰酶的酶促反应后电泳时，常使用本制品。,(DNA用),10Loading Buffer(RNA电泳用)组份浓度 配制量10 ml配制方法 称量下列试剂，置于10 ml离心管中。2.向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。3.加入5 ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。4.用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。,4、电泳缓冲液(10*)TAE TBE TPE,50TAE Buffer(pH8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸,100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。4.加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。,10TBE Buffer(pH8.3)组份浓度配制量配制方法,10MOPS Buffer 组份浓度200 mM MOPS,20 mM NaOAc,10 mM EDTA配制量1 L配制方法 1.称量41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。4.再向溶液中加入下列试剂。5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。6.用0.45 mm滤膜过滤除去杂质。7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。,凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围,上样注意事项,加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡；每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品孔形状与容量；每孔最大上样容积决定于样品孔体积；DNA marker可在两侧的样品孔均加上,电泳注意事项,电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确；电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极铂金丝是否有气泡出现，如负极的气泡（H2)比正极的(O2)多一倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟后可见指示剂溴酚蓝向正极移动；电泳过程中，EtBr向负极移动，与DNA的泳动方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中EB的含量降低，对于含量较少的DNA fragment检测困难，可重新染色凝胶中加入EB 进行电泳，便于随时紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线性DNA迁移率下降,1、凝胶制备：称取1g agarose,加100ml 0.5 TAE or TBE，微波炉或电炉溶解。2、制胶：待熔化的agarose温度降到60以下后，将agarose倒进插了梳子的胶盒中。30-40 min后，胶完全凝固，取梳子，将胶放入电泳槽中，缓冲液没过胶约 0.5 1cm。3、制样：根据上样缓冲液的浓度加样，如6*loading buffer,则1ul loading buffer+5 ul DNA sample,类推。4、点样：用移液器将DNA加到样品孔中。注意加DNA Marker。5、接通电源，红为正极，黑为负极，DNA往正极移动，1-5V/cm，6、根据指示剂移动位置决定终止电泳。将电压调到零，关机，再取出凝胶，EB染色10-20分钟，紫外灯下观察，照相。,Total RNA from Arabidopsis plants,Total RNA from Arabidopsis Plants,2011-5-24,
