实验室检测技术概要.ppt
实验室常用检测技术简要介绍,主要内容,概述 疾病鉴别诊断过程临床症状和大体病变检 病料的采集及处理 实验室检验病料中细菌的检测病料中病毒的检测,一、疾病鉴别诊断过程,临床标本的采集及处理 原则合理的采样时机正确的采样方法适宜的采样部位,一、标本采集 尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料 死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。,二 标本的保存和运送 尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4；时间延误较长，置-70。如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。三 标本处理1 体液 可以直接接种、检测2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料,病原学检测常用的实验室技术,分离培养（“金标准”）形态学检查（病毒 电镜镜检）细菌的生化试验动物实验免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR,二、病料中细菌的检测方法,细菌的形态学检查细菌的分离培养细菌的生化试验动物试验血清学试验分子生物学方法,光学显微镜下细菌的形态,细菌的形态观察,光镜和电镜的比较,大肠杆菌,葡萄球菌,电镜镜检,光学显微镜镜检,培养结果,初次分离,纯培养,鉴别培养,不乳糖,发酵乳糖,麦康凯平板,不发酵乳糖的细菌,大肠杆菌，呈现黑色金属光泽,EMB平板,SS平板,大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,发酵乳糖的某种肠杆菌。,HE（苏木素伊红)琼脂平板,本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。361培养1824h，观察结果。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球菌生长被抑制。,革兰氏染色,革兰氏阳性,革兰氏阴性,染色原理及过程：初染（结晶紫）媒染（碘液）脱色（95酒精）复染（复红）,细菌的生化试验,硫化氢试验,糖发酵试验,MR试验,VP试验,靛基质试验,药敏试验示意图,涂布细菌,贴上药敏纸片,1,2,温箱培养,3,4,以大肠杆菌为例：,剖检（采集病料）纤维素渗出物的涂片染色分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板）培养物涂片G染色生化试验动物试验血清学实验 玻板凝集鉴定血清型,三、病料中病毒的检测,病毒分离和鉴定的一般程序,常用检测方法,分离培养血清学 中和试验 补体结合试验 血凝及血凝抑制试验 免疫扩散试验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化分子生物学检测 PCR 分子杂交技术,病毒分离,1动物接种,病毒的分离与鉴定,2鸡胚培养,3组织培养,病毒中和试验,本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体等。,virus,补体结合反应,溶血（-）,不溶血（+）,免疫扩散,电镜技术,鸡痘病毒（超薄切片）,狂犬病毒包涵体（Negri body）,ELISA分类,ELISA Procedures,分子生物学方法,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)荧光实时定量PCR（real time PCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）,PCR原理:实质就是体外基因复制技术,加热变性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,原理图示,一,二,三 完成一个循环,30次循环后靶序列扩增的数量,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,荧光定量PCR Taqman 技术,特异性荧光双标记探针Taq酶 53外切酶活性,染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体；染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。,与DNA结合时发光,游离时不发光,SYBR Green I染料法,举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定量PCR方法。实验结果：,图2.3：标准曲线,市场上常见的实时荧光PCR仪,谢谢！,
