实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳.ppt
2023/10/12,1,cellulose acetate membrane electrophoresis,实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,2023/10/12,2,【实验目的】,掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义,2023/10/12,3,电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术,【实验原理】,2023/10/12,4,H,OH,H,OH,pHpI pH=pI pHpI,2023/10/12,5,电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即,V粒子运动的速度 X电场强度Q粒子所带电荷 r粒子的半径介质的粘度,2023/10/12,6,影响电泳速度的因素,1.样品本身：,分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。球形分子 纤维状分子,Q越多，u越大；,分子小，r越小，u越大；,2023/10/12,7,2.缓冲溶液：,pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大,离子强度(I)：I越大，电动电势越小，u越小；I越小，电动电势越大，u越大，但样品易扩散。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定,选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.020.2之间。,2023/10/12,8,电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。,3.电场强度(X),X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。,电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离,2023/10/12,9,4.支持介质：,纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜)凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶),2023/10/12,10,负极,正极,表面带负电荷,带正电荷的水层携带粒子向负极移动,如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。,电渗作用：,电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。,以纸电泳为例:,2023/10/12,11,区带电泳的分类,（一）支持物物理性状1滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜)电泳2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。,2023/10/12,12,（二）支持物装置形式：,1平板式电泳：支持物水平放置；,2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳,2023/10/12,13,(三)pH连续性：1连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2非连续pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等,2023/10/12,14,醋酸纤维薄膜为支持物 pH=8.6的巴比妥缓冲液 血清蛋白的pI均小于8.6 负电荷 电泳时向正极移动 由于迁移率不同而被分离,2023/10/12,15,分子越小，泳动速度越快 带电量越多，泳动速度越快,2023/10/12,16,膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。,2.定性,定量,各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。,可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。,用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。,2023/10/12,17,醋酸纤维薄膜：醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜 广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析,血清蛋白、血红蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、类固醇及同工酶等,2023/10/12,18,优点：简单快速缺点分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE）不适于制备（薄膜厚度约10100m，样品用量很少）,2023/10/12,19,【器材及试剂】,1、器材：醋酸纤维薄膜（28cm）常压电泳仪 竹镊 点样器 人血清或鸡血清 粗滤纸,2、试剂：巴比妥缓冲液 氨基黑10B0.25染色液 漂洗液 透明液,2023/10/12,20,操作,（一）仪器与薄膜的准备,1、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择,2.电泳槽的准备,3、电极槽的平衡,2023/10/12,21,（二）点样,取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上 点样区距阴极端1.5 cm 血清均匀涂在点样器表面 将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内 形成一定宽度、粗细均匀的直线 实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节,2023/10/12,22,（三）电泳,点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥(点样面朝下)另一端平贴在阳极端支架 要求：薄膜紧贴滤纸桥并绷直，薄膜之间相隔几毫米 盖电泳槽盖，平衡10min 打开电源开关，调节电流强度为0.3mA/片，通电10min 调节电流强度为0.5mA/片，电泳6090min 电泳后调节旋钮电流为O，关闭电泳仪切断电源,2023/10/12,23,DYY-5型稳压稳流电泳仪,DYY-型电泳槽,2023/10/12,24,2023/10/12,25,2023/10/12,26,【实验注意事项】,不要用手触摸纤维素膜 注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面 点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘太近 不要重复点样 膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极,2023/10/12,27,用点样器点样时不要点的太多，但也不能太少 线条均匀，用力水平。电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液,2023/10/12,28,（四）染色和漂洗,取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 min 自来水冲洗，漂洗液漂洗 更换3次漂洗液，脱去颜色，得到色带清晰的电泳图谱,2023/10/12,29,【实验结果】,绘出电泳图谱并标明各条带含义,2023/10/12,30,2023/10/12,31,临床意义,血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量6080g/L 绝大部分由肝脏合成，仅球蛋白由浆细胞合成 正常值：白蛋白5772，1球蛋白25 2球蛋白49，球蛋白6.512 球蛋白1220,2023/10/12,32,临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系：正常人A/G1.52.5,2023/10/12,33,血浆蛋白的主要功能,维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值，维持酸碱平衡 运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等 免疫作用,2023/10/12,34,白蛋白降低：合成能力不足：肝功能下降 合成原料不足：饥饿，腹泻，肿瘤晚期 去路增加：肾病综合症，严重烧伤，大出血等 消耗过多：糖尿病，甲亢等,2023/10/12,35,球蛋白增加：感染，多发性骨髓瘤，自身免疫性疾病等,球蛋白降低：皮质功能亢进，免疫缺陷病,2023/10/12,36,肝病：A,2-G,-G,1-G,-G，A/G下降甚至倒置,肾病：早期：选择性蛋白尿，Mw较小蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白后期：非选择性蛋白尿，Mw较小的蛋白质丢失，含量下降 分子量较大的蛋白质（如-球蛋白）丢失，含量下降,2023/10/12,37,【实验思考】,1电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？2电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种 成分？请分析原因,2023/10/12,38,【常见问题及原因】,1.电泳图谱不齐：点样时血清滴加不均,2.电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或电泳槽密闭性不 良，或电流过大，造成水分蒸发薄膜干燥,3.分离不良：标本滴加过多,4.区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075,2023/10/12,39,5.区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05,6.染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋白量过高 减少样品用量或延长染色时间,
