实验动物遗传学质量控制.ppt

第二章实验动物遗传学质量控制Genetics Quality Control of Laboratory Animal,本章在实验动物学中的位置,遗传学质量控制近交系、封闭群、杂交F1代、突变系,微生物及寄生虫学质量控制普通、清洁、SPF、无菌动物,营养学与饲料质量控制营养需要、标准、饲料配方、质量控制,环境与设施温度、湿度、噪音、洁净度等环境因素的控制,常用实验动物的特点生物学特性、品种品系、用途、繁育生产,概念、内容、分类、应用、发展概况、方向、福利及3R原则等,选择与应用原则、回避、生物医学主要研究课题中的选择,人类疾病动物模型概述、复制原则、方法、常用模型,动物实验基本技术各种实验技术、方法,本章主要内容实验动物的遗传学分类近交系动物封闭群动物杂交F1代动物突变系动物遗传质量检测,为什么要进行实验动物的遗传质量控制？实验动物是以科学实验为目的，专门培育的动物。由于科学工作者在实验研究中对实验动物不断提出更高的要求，希望有各种更为合适的动物类型来完成科学实验，因而促使实验动物工作者从遗传学控制的角度选择、培育和生产实验动物。另一方面，动物实验结果的重复性取决于动物个体差异的程度，而动物个体特征主要受遗传基因控制，因此，实验动物遗传学质量控制是取得准确动物实验结果的根本保证。,第一节 实验动物的遗传学分类,一、几个基本的名词和概念 1、染色体和基因 动物细胞中的染色体，除雄性的一对性染色体（sex chromosome）之外，其余成对的染色体其形态、大小都完全都是一样的，称为同源染色体。同源染色体在不同种动物数目不同，在人的体细胞是23对，小鼠是20对。同源染色体的其中一条来自父本，另外一条来自母本。,基因排列在染色体上，凡是在同源染色体占有相同位置的基因，叫作等位基因（allele），一对等位基因是决定相对性状的基因，它们可以是一样的，也可以不一样。遗传学家认为最初的基因都是野生型（wild-type gene），不一样的基因是由野生型基因突变而来。,在一个体中，细胞同源染色体上占据同一位点的两个等位基因如果相同，称该位点为纯合位点，如不同称杂合位点，自然界的动物体内往往同时存在杂合位点和纯合位点。,2、性状 性状是生物中可以观察到的形态、生理、生化或心理特征等。等位基因决定相对性状，存在显性和隐性的关系。当一个基因位点处于杂合状态时，生物只显示显性基因（dominant gene）所决定的性状，隐性基因（recessive gene）所决定的性状被显性基因所掩盖。,种群中一个座位的基因有两种以上变化形式时称为复等位基因（multiple alleles）。家兔C位点毛色基因：C Cch Ch c 单一色 青紫蓝 喜马拉雅 白化 CC,CCch,CCh,Cc 单一色 CchCch Cch Ch Cch c 青紫蓝 ChCh Chc 喜马拉雅 cc 白化,New Zealand white rabbit,chinchilla,Himalayan rabbit,喜马拉雅兔 该兔全身被毛白色，只有双耳、鼻、四肢及尾巴为黑色，故又称“八点黑兔”。成年兔体重一般44.5公斤，红眼睛，体质结实，性情温顺。,3.遗传学三大基本定律Mendel 遗传定律：分离定律、自由组合定律摩尔根（Morgan）：连锁交换定律,1953(April)James Watson and Francis Crick discover the double helical structure of DNA(Nature).,近交系 inbred strain(包括突变系 mutant strain)遗传学分类 封闭群 closed colony 杂交F1代 hybrid F1(遗传特点)杂交群 hybrids 其它杂交群,二、遗传学分类 从遗传学观点来看，实验动物是遗传限定的动物，因为在实验动物培育过程中，采取了近交、回交、随机交配等方法对所形成实验动物的遗传组成进行了限定，以保持其遗传稳定或形成特定的遗传组成。根据遗传特点的不同，实验动物分为近交系、封闭群和杂交群。,不同基因类型封闭群 closed colony、其它遗传学分类 近交系 inbred strain（包括（基因纯和 相同基因类型 突变系mutant strain）程度）杂交F1代 hybrid F1,实验动物按基因纯和程度可分为相同基因类型和不同基因类型两大类。近交系动物又包括普通近交系、重组近交系、重组同类系、同源突变近交系、同源导入近交系等。,大量资料表明，不同基因型的动物，其生物学特性具有明显差异，对外来刺激呈不同反应。如：解剖学上同龄的近交系BALB/c小鼠与A系小鼠相比，BALB/c小鼠脊椎较大，脑重体重比较高，脾及胸腺的重量也较重。一般来说，近交系、突变系、杂交F1代动物种群内个体之间生物学特性非常一致，而封闭群内动物个体之间差异较大。随着生物工程技术的进步，新型实验动物不断涌现，如转基因动物、嵌合体动物等。,三、实验动物品种、品系的概念1.种 种(species)是生物学分类的最基本单位，是一群形态相似、能相互交配的自然群体，它们在生殖上与其他群体相隔离。种以下还可有进一步小的分类，如品种(stock)、品系(strain)。在实验动物分类系统中，品种和品系是基本分类单位。脊椎动物门哺乳纲啮齿目鼠科大鼠属大鼠种。2.品种 品种一般系指具有一些容易识别和人们所需要的性状，而且可以基本稳定遗传的动物群体。如新西兰白兔、青紫兰兔、Wistar大鼠、KM小鼠等。3.品系 在实验动物学中把基因高度纯合的动物称作品系动物。例如，C57BL/6是近交系动物中的一个品系，属低癌组、高补体活性的动物。又如，肌萎缩症(dystrophia muscularis)小鼠是带有突变基因(dy/dy)的品系动物。,四、作为品系、品种的条件(一)相似的外貌特征：例如C57BL/6品系小鼠的毛色是黑色的，DBA/2品系的毛色是灰色的，KM小鼠的毛色是白色的。(二)独特的生物学特性：例如A品系，在经产鼠中高发乳腺肿瘤，对致癌物质敏感，易产生肺癌，老年鼠多有肾脏病变；AKR品系自发淋巴细胞白血病；ICR品种繁殖能力强。(三)稳定的遗传性能：即在品系、品种自群繁殖时，能将其特性稳定地传给后代。(四)具有共同遗传来源和一定的遗传结构：任何品系品种都可追溯到其共同的祖先，并由此分支经选育而成，其遗传结构也应是独特的。例如KM小鼠Glo-1位点为a基因单一型，而NIH小鼠在该基因呈多态分布，a、b型基因频率分别为67%和33%。,目前，世界各地共培育着200多种共计26000多个实验动物品系，其中2607个为常规实验动物品系。我国实验动物（包括实验用动物）资源30种共计1100多个品种、品系，其中常规品系103个。,小鼠种系资源比较遗传分类 国际 国内近交系 4303 20突变系 11616 30基因工程品系 2930 1000其他品系 2971 7总计 21820 1057引自Jackson Lab website,大鼠种系资源比较遗传分类 国际 国内常规品系 1637 10突变系 301 7基因工程品系 221 0其他品系 43 0总计 2202 17引自Jackson Lab website,第二节 近交系动物,一、基本概念 近交系是指经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。经连续20代以上亲代与子代交配与全同胞兄妹交配有等同效果。在一个动物群体中，任何个体基因组中99%以上的等位位点为纯合时定义为近交系。近交系的近交系数（inbreeding coefficient）应大于99%。这种动物在自然界里并不存在，是经人工专门培育而成。,巴马香猪,版纳小耳猪（滇南小耳猪）云南农业大学曾养志教授已近交20代,二、近亲繁殖：1.什么是近亲繁殖?近亲繁殖就是将亲缘关系比较近的个体进行交配，如兄妹交配（bs）、亲子交配（p）等。近亲繁殖的目的为增强纯合性。2.近亲交配的结果：(1)遗传基因趋向于纯合 近亲交配的结果使纯合子数量增加，杂合子数量减少，近交形成不同的品系。AA aa Aa AA+Aa+Aa+aa aa Aa AA,(2)近交衰退 在近亲繁殖的实践中，通常伴随着遗传缺陷的出现，生命早亡较多，动物体质普遍较差，并且较为容易感染疾病，生产能力减退和隐性基因暴露增多，这个现象叫“近交衰退”。这种有害影响是由于若干对不利的隐性基因纯合造成的，如不能产生正常生活所需要的酶，或者产生不正常的蛋白质或其他化合物，或激素的不平衡。衰退的原因：随着纯合基因位点的增多，有害的隐性基因暴露增多，一般有害基因为隐性基因，其性状被正常的显性基因所掩盖，当隐性基因纯合时，常表现出遗传缺陷。多基因平衡的破坏导致生命活动的异常。过去认为“一个基因一个酶”，忽视了基因之间的作用。现在证明基因之间有相互作用，虽然相互的影响很小，但是由于长期自然选择、优胜劣汰的结果，使得有利生存的组合保存下来，近交使平衡关系破坏，引起异常。实践证明，近交到7-8代，最为困难，往往有断代危险，随着代数上升，可慢慢稳定。,(3)近交系数上升 近交系数是一个表示近交程度的函数，是表示一个种系的动物个体中两个等位基因具有相同来源的概率。近交系数的值随近交代数上升而上升。近交系数用“F”表示，F0表示完全杂合，F1表示完全纯合。近交系数F的值与近交代数有函数关系，可以用公式推算出来，Wright已经推算出一个近交系数表（bs）。,近交代数 近交系数(F)近交代数 近交系数(F)0.250 11 0.908 0.375 12 0.926 0.500 13 0.940 0.594 14 0.951 0.672 15 0.961 0.734 16 0.968 0.785 17 0.974 0.826 18 0.979 0.859 19 0.983 10 0.886 20 0.986,三、近交系的亚系（substrain）近交系的亚系分化是指一个近交系内各个分支的动物之间，已经发现或十分可能存在遗传差异。通常下述三种情况会发生亚系分化。1在兄妹交配代数达40代以前形成的分支（即分支发生于F20到F40之间）。2一个分支与其他分支分开繁殖超过100代。3已发现一个分支与其他分支存在遗传差异。产生这种遗传差异的原因可能是残留杂合、突变或遗传污染（genetic contamination）（即一个近交系与非本品系动物之间杂交引起遗传改变）。由于遗传污染形成的亚系，通常与原品系之间遗传差异较大，因此对这样形成的亚系应重新命名。例如由Glaxo保持的A近交系在发生遗传污染后，重新命名为A2G。,四.命名：小鼠标准化遗传命名国际委员会 近交系小鼠国际命名法 International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice Mouse News Letter 小鼠新闻通讯 Inbred Strain of Mice 近交系小鼠,1.近交系一般以大写英文字母命名，应尽量简短，一般个字母，例如A、AE、DBA、STAR等。2.有些命名可在大写字母中间加一些阿拉伯数字，如C3H、C57BL等。3.近交系的近交代数用大写的英文字母F表示，例如当一个近交系的近交代数为87代时，写成(F87)。如果资料不全，可以只写上已知的代数，如AKR(F?+10)等。4.亚系的命名是在原品系名称后加一道斜线“”斜线后标明亚系的数字或符号。例如，DBA1、DBA2、C57BL6J等。新国标增加了染色体置换系、核转移系。,5.有时一些较早使用的非正规命名，已广泛为国际所共知，可以沿用。如615、129、101等。而昆明种小鼠、津白、津白、中国1号则改为：KM、TA1、TA2和C-1等。6.经人工处置形成的支系，在原品系名称后面加一个小写的英文字母以标明处置方式，具体符号是：卵子移植:e(egg transfer)奶姆代乳:f(foster nursing)人工喂养:h(hand-rearing)卵巢移植:o(ovary transplant)例如，“TA1f615”表示由615品系代乳的TA1近交系。,7.缩写 C3H=C3 H CBA=CB C C57BL/6=B6 C57 C57BL=B C57L=L BALB/c=C c DBA/2=D2 A2 DBA=D,五、特性1基因纯合性（homozygosity）。在一个近交品系内所有动物的基因位点都应该是纯合子，这样的个体与该品系中任何一个动物交配所产生的后代也应该是纯合子，在这些动物中没有暗藏的隐性基因。2同基因性（isogeneicity）。由于近交系动物是相同基因型的动物，因而任何可遗传的体征都完全一致，例如血型和组织型，形态学上的特征（体重、毛色等），甚至行为的类型也趋于一致。在同一品系内动物个体间进行皮肤和肿瘤移植不被当作异物排斥。如用生化或免疫学的方法检测个体在各染色体上的基因标记，同一品系内不同个体间的基因标记完全一致。,3遗传稳定性（genetic stability）。已建立的近交系动物在遗传上具有高度稳定性，个体遗传变异仅发生在少量残留杂合基因和基因突变上，而这种机率非常低。如果品系在被确认为近交系后坚持近交，同时辅以遗传监测（genetic monitoring），及时地发现和清除遗传变异的动物，该品系的遗传特性可世代相传。如DBA小鼠已维持了近100年。所以近交系动物是永不死的个体。,4个体性（individuality）就整个近交系小鼠而言，每个品系在遗传上都是独特的，几乎每个近交品系都建立了各自的遗传概貌，用遗传监测方法，可将两个外貌近似的品系分辨出来。有些品系可能自发某些疾病，成为研究人类疾病理想的动物模型。在某些情况下，品系间的差别显示在量上，而不在质上，这一点在研究上也非常有用。因此可在众多的近交系中筛选出对某些因子敏感和非敏感的品系以达到不同的实验目的。如：津白I（TA1）为抗癌品系；TA2为高乳腺癌。C57BL/6低发癌，对放射线耐受性强，BALB/c对放射极为敏感。,5分布的广泛性（extensive distribution）近交系动物个体具备品系的全能性，任何个体均可携带该品系全部基因库，引种非常方便，仅需12对动物。目前，大部分近交系动物分布在世界各地，这从理论上意味着不同国家的科学家有可能去验证和比较已取得的数据。6背景资料可查性（retrievalable background date）由于近交系动物在培育和保种的过程中都有详细记录，加之这些动物分布广泛，经常使用，已有相当数量的文献记载着各个品系的生物学特征，这些基本数据对于设计新的实验和解释实验结果提供了便利条件。,近交系动物的基因特点？,六、应用 近交系动物与封闭群相比，个体之间极为一致，对实验反应一致，实验数据标准差较小，因此在实验中实验组和对照组都只需少量的动物。由于近交，隐性基因纯合性状得以暴露，可以获得大量先天性畸形及先天性疾病的动物模型，如糖尿病、高血压等。这些动物家系清楚，取材方便，是进行基因连锁分析、遗传学、生理学和胚胎生物学研究的理想实验材料。在某些涉及组织细胞或肿瘤移植的实验中，个体之间组织相容性一致与否，是实验成败的关键，在这里，近交系动物成为必不可少的实验动物。某些近交系具有一定的自发或诱发肿瘤发病率，并可使许多肿瘤细胞株在活体动物上传代，这些品系成为肿瘤病因学、肿瘤药理学研究的重要模型。多个近交系同时使用可使不同研究者分析不同遗传组成对某项实验的影响，或者观察实验结果是否有普遍意义。,七.常见近交系小鼠、大鼠(1)小鼠：近交系小鼠：BALB/c;C57BL/6;C3H;DBA/2;615;TA1(抗癌系)；TA2(高癌系)(2)大鼠：近交系大鼠：F344,八.近交系培育的方法：(1)平行线法 选择多个兄妹对（35个），每一代再分别从各对的后代中选一对兄妹交配生产下一代，如此类推，可以认为如果都不断代的话，培育出4个不同的近交品系。,表示一个兄妹对.,(2)单线法 从某一个家系选全同胞兄妹（35对）进行交配，每代只选留其中的一对做为下代繁殖用，最后形成一个品系。,表示一个兄妹对.,(3)选优法：首先象平行线一样，开始选择35个兄妹对，第一世代中的第2系因繁殖力低而被淘汰（从左右分别为1、2、3、4系），由3系的代替。其后2、4、1在以后世代先后被淘汰。分别由3系所替代。,表示一个兄妹对.,第三节 封闭群动物,一、基本概念 封闭群动物(closed colony)属不同基因型动物，又称远交群(outbred stock)，是指以非近亲交配方式进行繁殖生产的一个实验动物群体，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上。,在封闭群内，个体间的差异程度主要取决于其祖代来源，若祖代来自一般杂种动物，则个体差异较大，若祖代来自同一个品系的近交系动物，差异则较少。祖代来自近交系的封闭群又称非近交系(noninbred strain)和随机交配品系(random-bred strain)。某些封闭群携带个别突变基因，称突变种。这些突变可能是以纯合或杂合的形式存在于群体之中。培育者除了考虑封闭群的遗传组成之外，更加注意研究突变基因在封闭群中的保存和遗传规律，以及其应用价值。,二、命名 封闭群由24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。如：N:NIH表是由美国国立卫生研究院（N）保持的NIH封闭群小鼠。某些命名较早，又广为人知的封闭群动物，名称与上述规则不一致时，仍可沿用其原来的名称。如Wistar大鼠封闭群。此外，近交系命名中的规则及符号也适用于封闭群动物的命名。,三、特点 封闭群是一个长时期与外界隔离，雌雄个体之间能够随机交配的动物群。其遗传组成比较接近于自然状态下的动物群体结构。由于在远交种群中，个体之间具有遗传杂合性而差异较大，但是从整个群体来看，封闭群状态和随机交配使群体基因频率基本保持稳定不变，从而使群体在一定范围内保持有相对稳定的遗传特征。,封闭群在整体上由于没有引进新的血缘，其遗传特性及其反应性能保持相对稳定，但就群内个体间而言，因其有杂合性，所以个体间的反应性具有差异，某些个体反应性强，某些个体反应性弱，因此，个体间的重复性和一致性不如近交系动物好。封闭群动物具有杂合特性并避免了近交，从而避免了近交衰退的出现，所以，其生活、生育力都比近交系强，具有繁殖率高，疾病抵抗力强，故封闭群可以大量生产，供应量充足。,常见的封闭群动物 KM小鼠、ICR小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、青紫兰兔、新西兰兔、毕格犬等，尤其是中国昆明种小鼠，目前是使用最多的动物，其祖先可能是Swiss小鼠，1946年从印度引进我国昆明，以后又分送我国各地，因此得名“昆明种小鼠：KM小鼠”。,SD大鼠,毕格犬,青蓝紫兔,KM小鼠,四、应用 远交群动物的遗传组成具有很高的杂合性，因此在遗传中可作为选择实验的基础群体，用于对某些性状遗传力的研究。同时远交群可携带大量的隐性有害突变基因，可用于估计群体对自发或诱发突变的遗传负荷能力。远交群具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成，因此在人类遗传研究、药物筛选和毒性试验等方面起着不可替代的作用。远交群具有较强的繁殖力和生活力，表现为每胎产仔多、胎间隔短、仔鼠死亡率低、生长快、成熟早、对疾病抵抗力强、寿命长，加之饲养繁殖时无需详细记录谱系，容易生产，成本低，可大量供应，因而广泛应用于预试验、教学和一般实验中。突变种所携带的突变基因通常导致动物在某些方面的异常，从而可成为生理学、胚胎学和医学研究的模型。,五、繁殖 封闭群一般采用随机交配繁殖，就是在一群繁殖的动物中，每个个体都有同样的机会同另一性别中的任何一个个体进行交配并繁殖。因此，这种交配方法既不管其亲代来源，也不考虑它们的亲缘关系，所以是随机的。其目的是防止近亲繁殖，而不使后代中分离出独立的品系。随机繁殖可维护遗传异质性，因而没有近亲衰退现象。每代双亲的数目越大，则随机交配对的平均亲缘关系越远。因此为了减少近亲繁殖到一个最小限度，则远交群必须保持在最大可能饲养的双亲数量。如果一个原种要无限地维持下去，则近亲率（近交系数上升率）的目标应订在每代不得越过1%。为保持封闭群动物的基因异质性和多态性，引种动物数量要足够多，小型啮齿类封闭群动物引种数目一般不少于25对。,防止近交的原则是每一代的近交系数上升率应小于1%，近交系数上升率用“F”表示：F 2Ne（Ne群体有效大小）Ne应在50以上。1.在雄种数100只以上时，采取随机交配方式。2.雄种数10-25只时，采用最佳避免近交法。3.26-100只时，采用循环交配法。,第四节 杂交一代,一、基本概念：杂交群是指由不同品系或种群之间杂交产生的后代。杂交一代动物是由两个无关的近交系杂交而繁殖的第一代动物，简称F1代动物。F1代动物的遗传组成均等的来自两个近交系，属于遗传均一、基因型相同和表型一致的动物。,From FFrom M,From FFrom M,两个用于杂交生产F1代的近交系称为亲本品系(parental strain)，提供雌性的为母系(maternal strain)，提供雄性的为父系(paternal strain)。杂交F1代动物的每个基因位点上的两个等位基因分别来自母系和父系。如果亲本品系之间某个基因位点上的基因相同，则F1代在这个位点就为纯合基因；相反，如果不相同，则为杂合基因。尽管F1代携带许多杂合位点，但其个体之间在遗传物质组成上是一致的。严格地讲，F1代动物不是一个品种和品系，因为它不具有育种功能，即不能自群繁殖出相同基因型的动物。要进行F1代动物的繁殖只有同时保持两个亲本品系。,?,二、命名：F1代小鼠命名的方法是把亲代母系符号写在前边，亲代父系名称居后，以大写英文字母“X”相连表示杂交。将以上部分用括号括起，再在其后标明上F1，即为F1代的命名。近交系小鼠常用的品系有一些缩写标记，也可将两个亲本的近交品系缩写标记按雌雄的顺序写在一起，再加“F1”即为F1代动物的标准命名。如：C57BL/6DBA/2（C57BL/6XDBA/2）F1 可简写为：B6D2F1 DBA/2C57BL/6（DBA/2XC57BL/6）F1 可简写为：D2B6F1,同样两个近交系杂交可以培育出两个不同的杂交F1代。这两个杂交系的区别主要是：1.（C57BL/6XDBA/2）F1雄性的Y染色体，来自DBA/2；（XX）（XY）（DBA/2XC57BL/6）F1雄性的Y染色体，来自C57BL/62.母性因素：前者来自C57BL/6；后者来自DBA/2.(包括细胞质成分、子宫环境和母乳),三、特性与应用 杂交F1代有许多优点，在某些方面比近交系更适用于研究。(一)遗传和表型上的一致性：就某些生物学的特征而言，F1代比近交系动物具有更高的一致性，不容易受环境因素变化的影响，广泛适用于营养、药物、病原和激素的生物评价。(二)杂交优势：F1代具有较强的生命力，对疾病的抵抗力强，寿命较长，容易饲养，适用于携带保存某些有害基因和长时间的慢性致死实验，也可作为代乳动物以及卵、胚胎和卵巢移植的受体。(三)具有同基因性：杂交F1代虽然具有杂合的遗传组成，但其可接受不同个体乃至接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤的移植，适用于免疫学和发育生物学等领域的研究。例如单克隆抗体研究一般都用BALB/c小鼠，将获得的杂交瘤细胞注入该小鼠腹腔后即可产生肿瘤，同时产生高效价抗体的腹水。如采用BALB/c和其它近交系F1代小鼠作单克隆抗体制备，所产生的高效价抗体腹水量比单独用BABL/c小鼠要多。(四)作为某些疾病研究的模型：例如(NZBXNZW)F1是自身免疫缺陷的模型，(C3HXIF)F1为肥胖病和糖尿病的模型。,四、繁殖(一)杂交组合的选择：根据研究需要和各个品系特性选择杂交组合，例如C57BL/6品系的雌鼠与C3H品系的雄鼠交配产生BC3F1小鼠，该F1小鼠是乳腺癌低发病者。如果用C3H雌鼠与C57B/L6雄鼠杂交，其F1代属乳腺癌高发小鼠。建立F1代小鼠一定要通过不同杂交组合的对比观察，从中选出最理想的杂交品系组合。(二)交配方法：繁殖杂交F1小鼠的目的是为了能在一定时间内，提供较大量的遗传均一的实验动物，因此交配方法最好采用循环交配或定期交配进行生产。这种交配方法，可使9095的SPF小鼠在同居后第一个发情期怀孕，因此每胎生产日期比较集中，可成批提供数量较多，体重和年龄较为接近的F1代小鼠。,常见杂交F1代小鼠使用频率杂交F1代品系 频率 颜色 杂交F1代品系 频率 颜色B6D2F1 19.9 黑色 CBB6F1 2.4 野鼠色BDF1 6.6 黑色 C3B6F1 2.0 野鼠色（NZBXNZW)F1 4.2 野鼠色 BC3F1 2.0 野鼠色B6C3F1 4.2 野鼠色 BCBF1 2.0 野鼠色C3D2F1 3.8 野鼠色 CBBF1 2.0 野鼠色B6AF1 3.8 野鼠色 CD2F1 1.7 棕色LAF1 3.5 棕色 CB6F1 1.7 黑色B6CBF1 3.1 野鼠色 其余 36.4/,国际上常用的杂交一代小鼠杂交一代名称 杂交一代的亲代名称 杂交一代名称 杂交一代的亲代名称 AKD2F1 AKRDBA/2 CBA-T6D2F1 CBA-T2 DBA/2 BA2GF1 C57BL A2G CB6F1 BALB/c C57BL/6 BCF1 C57BL BALB/c CCBA-T6F1 BALB/c CBA-T6 BCBAF1 C57BL CBA CC3F1 BALB/c C3H BC3F1 C57BL C3H CD2F1 BALB/c DBA/2 B6AF1 C57BL/6 A CLF1 BALB/c C57L B6D1F1 C57BL/6 DBA/1 C3BF1 C3H C57BL CAF1 BALB/c A C3D2F1 C3H DBA/2 CAKF1 BALB/c AKR C3LF1 C3H C57L CBAAF1 CBA A 129B6F1 129 C57BL/6,第五节 突变系动物,一、基本概念 突变系动物是带有突变基因的品系动物。动物遗传基因发生突变而具有某些特殊性状表现。人们把发现的具有突变基因的动物称为突变株，相同突变株的动物为突变系。,近交系动物发生基因突变，除去突变了的基因与原来品系不一样外，其余都一样。也叫同源突变近交系。,二、命名：突变动物的命名是在原品系名后加突变基因符号，再用连字符“”相连。如：NIH-nu/nu NIH-nu/+BALB/c-nu/nu BALB/c-nu/+,三、繁育培育突变系分为两个阶段：1、发现新的突变种。2、将其品系化，把携带目的基因同时又有繁殖能力的兄妹对进行交配20代以上。,四、应用 目前，国际上小鼠突变系已有11616个，大鼠突变系已有301个。这些突变型动物，有的已应用在科学研究中，特别是那些与人类某种疾病表现类似的突变型动物已用做动物模型进行研究。如与人类疾病相似的肥胖症和糖尿病小鼠、肌肉萎缩症(dy)小鼠、溶血性贫血(ha)小鼠等。,五、常见突变系：1、肥胖症和糖尿病小鼠（Obesity and diabetes,ob）：ob突变系小鼠纯合子46周龄时，糖尿病开始发作，910周龄发病率最高，所患糖尿病与人的糖尿病非常相似，在临床医学研究经常采用。2、肌肉萎缩症小鼠（Dystrophia muscularis,dy）：dy纯合子小鼠出生两周之内后肢萎缩，步行困难，与人的肌肉营养障碍症十分相似。3、无胸腺裸小鼠（Nude mice,nu）,六、裸鼠 T淋巴细胞功能缺陷的动物有裸小鼠(基因符号nu)和裸大鼠(基因符号rnu)，利用育种技术已将裸基因nu或rnu导入其它品系动物，作为背景品系可以是近交系也可以是封闭群，目前nu基因已导入的近交系有数个以上。rnu基因导入的大鼠品系也有10余种。我国使用较多的裸鼠品系BALB/c-nu、NC-nu、Swiss-nu、NIH-nu。1980年和1982年中国药品生物制品检定所分别从瑞士和日本引进裸小鼠，上海中山医院肝癌研究所1983年从美国引进了裸大鼠Rowett。,一、裸小鼠(一)概念及命名：1962年英国格拉斯医院Grist 在非近交的小鼠中偶然发现有个别无毛小鼠，后来证实是由于基因突变造成的，并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠(nude mice)，用“nu”表示裸基因符号。裸小鼠是由于第11号染色体上基因突变引起的，已失去正常胸腺，原胸腺残留结构部分上皮样细胞呈巢状排列而部分呈外分泌腺结构。裸鼠淋巴结胸腺依赖区的淋巴细胞消失，外周血中淋巴细胞数目减少。1969年丹麦Rygaard首先将人类结肠腺癌移植裸小鼠成功，为免疫缺陷动物研究和应用开创了新局面。,(二)特性：裸小鼠的主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺，仅有胸腺残迹或异常上皮，这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸鼠由于T淋巴细胞缺陷，不能执行正常T淋巴细胞功能，无移植排斥。裸小鼠B淋巴细胞正常，但功能欠正常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。成年裸小鼠(68周龄)较普通鼠有较高水平的NK细胞活性，但幼鼠(34周龄)的NK细胞活性低下。,(三)繁殖：裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，因而饲养和繁殖要求条件比较严格，在屏障环境下可生存，所用的笼具、垫料、饲料、饮水等都要求经过严密灭菌消毒，以保证长期存活并进行繁殖。由于纯合型雌裸小鼠nu/nu受孕率低，乳腺发育不良且有食仔的习惯，因此生产上一般采用纯合型雄鼠与杂合型雌鼠交配(nu/nunu/)可获1/2纯合型仔代。,二、裸大鼠(一)概念及命名：裸大鼠由英国Rowett研究所在1953年发现，基因符号为rnu，属染色体隐性遗传。裸大鼠免疫器官的组织学与裸小鼠极为相似。3 周龄裸大鼠纵膈的连续切片中，只见胸腺残体，未见淋巴细胞，淋巴结副皮质区实际上无淋巴细胞。T 细胞功能丧失。,(二)特征：裸大鼠的一般特征似裸小鼠，但躯干部仍有稀少被毛并非象裸小鼠那样完全无毛，头部及四肢毛更多，繁殖方法与裸小鼠相同。裸大鼠易患呼吸道疾病。裸大鼠的发现及人癌异种移植成功，给肿瘤免疫研究增添一个新的手段。以裸大鼠代替裸小鼠，具有移植肿瘤大，血量多，可行某些外科小手术等优点。因此比裸小鼠有一定优越性，其缺点是维持经费比裸SPF小鼠更高。,三、应用 1.裸鼠在肿瘤学方面的应用 人类肿瘤(癌组织块和成株的细胞系)的裸鼠移植可以建立裸鼠移植瘤，从而开展肿瘤基础和临床研究的各种重要课题。有人提出通过模型的实验治疗和肿瘤在裸鼠体内发展情况观察来指导临床实际病人的治疗和推测其预后。2.裸鼠在微生物学和免疫学方面的应用 裸鼠由于功能性T淋巴细胞缺损，免疫机能低下，是研究病毒、细菌感染机制的极好模型动物。生物制品(疫苗、菌苗)的安全性和免疫原性是制品必不可少的检查内容，这涉及制品是否有潜在致癌性、感染因子以及它的毒力是否有返祖的可能性。在这些方面裸鼠是很好的实验动物模型和手段。3.在遗传学上的研究和应用 裸鼠的遗传因素，因遗传背景的不同，所表现的细胞免疫反应和实验室检查指标亦各不相同。这些裸鼠种群是研究人类各种免疫缺陷性疾病发病机理和遗传规律的动物模型。4.在临床医学上的研究和应用 如神经外科学，利用裸鼠异种移植离断后的神经，观察离体后的神经元的生物学特征。,第六节 遗传质量检测,一、意义 遗传检测主要指实验小鼠的遗传检测。近交系小鼠遗传检测的意义就在于按照小鼠标准化遗传命名国际委员会的标准审核近交系，把一切改变的等位基因予以剔除。远交群遗传检测的目的在于保持遗传上的稳定性，即在一个群体内所有基因的基因频率始终保持不变，从而保持现存的遗传杂合性。,二、遗传改变的原因(一)近交系基因改变的原因1.一个外来的基因组杂交进一个近交系，由于这种杂交所产生的遗传污染不仅仅是一个基因位点，污染程度远远超过基因突变或遗传杂合性的出现，它的发生也不是间断的逐渐积累发生的变化。这种污染多见于几个品系，特别是几个白化品系饲养在一起时，如果饲养员未经过训练、素质差，则加剧这种污染的发生。2.残余的杂合性 尽管我们采用严格的兄妹交配，近交系在某些位点上仍保留残余的杂合性。还有一个值得考虑的因素就是杂合子遗传型的个体在受精率、繁育率和生活力上均超过纯合子个体，故它易于繁衍和扩大。3.遗传突变 遗传突变在哺乳类动物中的频率为10-5。现代科学证明遗传突变主要来自DNA序列的变化，这种变化可能是某核苷酸的置换、缺失或插入，从繁育体系上看，突变只有发生在代表血统的那些个体上，突变才能真正起作用。,(二)远交群基因改变的原因：同近交系一样，遗传污染和基因突变都能造成远交群的差异，但远交群等位基因分布频率改变的主要原因在于选择，要保持一个远交群所有基因频率的相对比例没有变化，最恰当的核心繁育群应有1000个动物，但事实上我们不可能做到这一点，特别是近代，人们为了控制微生物污染，采用剖腹产和悉生生物学技术定期地重建新的群体，在重建过程中，群体骤然变小，近交系数必将上升，因而导致杂合性下降，这也意味着某些基因被固定。在不同的单位这种对位点的不同固定往往导致了同一品种动物等位基因分布的改变。,三、遗传检测的方法1.生化标记基因检测（biochemical markers)2.免疫学检测 包括皮肤移植(skin grafting)、免疫标记基因检测(immunogenetic markers)等方法。3.形态学检测 包括下颌骨测量法(mandible measurement)、染色体标记检测（cytogenetic techniques)和DNA多态性检测法(DNA markers)等。4.毛色基因测试法(coat gene testing)以上几方面的方法实际上不可能全部采用，但也不能以单一的方法作为依据，应从生化标记，形态学和免疫学等方面综合判断一个品系的遗传概貌是否发生改变较为妥善。,四、遗传学检测方法(一)生化标记基因检测法：生化标记基因检测是近交系动物遗传纯度常规检测中的常规方法，近交系小鼠选择位于10个染色体上的14个生化位点，近交系大鼠选择11个生化位点，作为遗传检测的生化标记。常使用醋酸纤维膜电泳技术。将待检标本(血清、肾匀浆等)点样，走电泳，显色。然后分析得到的电泳图谱，确定各待测位点的基因型，然后把这些基因型与各品系标准遗传概貌对比，列出相同与不同的基因位点。从而判断被检测品系的纯合程度。,碳酸酐酶-2（Car-2）,样品：溶血素,蛋白染色法,C57BL/6 慢带 a,DBA/2 快带 b,待测动物1待测动物2,待测动物3,C57BL/6快带 a,CBA/N 慢带 b,待测动物1,待测动物3,酯酶1（Esterase-1,Es-1）样品：血清，酶显色板法,待测动物2,(二)皮肤移植法 小鼠皮肤移植是纯系动物遗传质量控制的基本方法之一，其方法简单，操作方便，可靠性好。小鼠与人类在其相应的染色体上有控制移植成活的一组基因位点，组成了主要组织相容性复合体(MHC)或主要组织相容性系统(MHS)，小鼠的MHC称为H-2复合体，位于第17条染色体，决定小鼠的主要组织相容性抗原(相当于人的HLA系统)。小鼠组织相容性基因位点已知有56个，如H-1、H-2、H-3H-56。由于组织相容性基因是共显性的，所以能单独在杂合中表达。各组织相容性位点的抗原具有不同强度的抗原性。小鼠的H-2位点是强抗原，引起对同种移植物产生强的排斥反应，使移植的皮肤约在十一天内被破坏。其余的H位点都是弱抗原。又称为次要组织相容性抗原，这些位点对同种异体的移植物仅能导致延缓的排斥，这种排斥作用有的可维持长达百天左右。皮肤移植法测试时，每个品系抽取至少4只相同性别的成年动物，进行同系异体皮肤移植。移植全部成功者为合格，发生非手术原因引起的移植物的排斥判为不合格。,（三）毛色基因测试法1.基本原理：小鼠的毛色等位基因A、B、C、D分别位于第2、4、7