实验六 细胞核的分离与核酸的鉴定.ppt

实验6 细胞核的分离与核酸的鉴定（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids）,遵义医学院生物化学教研室 曹桂群,1.掌握离心技术的原理及离心机的使用；2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；3.熟悉鉴定核酸的方法；,一、分离细胞质与细胞核,.破碎细胞,细胞破碎的方法,机械法,高速组织捣碎机,玻璃匀浆器,研钵,物理法,超声匀浆器,冻融法,化学法,自溶法,酶处理,表面活性剂处理法,利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。,.离心技术,细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。,离 心 方 法,差速沉降离心法,速率区带离心法,等密度区带离心法,密度梯度区带离心法,差速沉降离心法(differential centrifugation),采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。,加速,低速,高速,差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。,缺点：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。,每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为：V=d218(-s)2r。,V：是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）；d：样品颗粒的直径（厘米）；：样品颗粒的密度（克/厘米3）；s：介质溶液的密度（克/厘米3）；：介质溶液的粘性系数（克/厘米秒）；：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），=2N60，N：转/分；r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；,密度梯度离心法的理论依据,待分样品的沉浮行为如何确定？,当S时 V0即样品顺离心力方向沉降S时 V0即样品逆离心力方向上浮=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。,速率区带离心法,人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒（沉降速度差为20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分离密度相似而大小有别的样品。,样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。,等密度区带离心法,此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。,优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。c.颗粒不会挤压变形。缺点：a.离心时间较长；b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。,密度梯度区带离心法(density gradient centrifugation),1、核酸的种类及其分布,请思考？,DNA、RNA在细胞中的分布：,DNA,胞核内(98%),胞质内(2%),RNA,胞核内(10%),胞质内(90%),核酸的种类：,DNA、RNA,结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。,二、核酸的鉴定,2、核酸的水解,核 酸,核苷酸,磷 酸,碱 基,戊 糖,定糖法（戊糖的差异）,（1）核糖核酸的鉴定,浓HCl,3H2O,+,D核糖,糠醛,糠醛,3，5二羟基甲苯,绿色化合物,RNA,水解,D核糖,（2）脱氧核糖核酸的鉴定,DNA,水解,D脱氧核糖,-H2O,硫酸,脱氧核糖,羟基酮基戊醛,蓝色化合物,（1）分离细胞质与细胞核,（1）分离细胞质与细胞核,（2）核酸的鉴定,0.5g肝组织 少许石英砂研磨,加5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤,肝匀浆，倾入离心管,离心：3000r/min；10,上层液,沉淀,加入1ml 0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液,核悬液,沿壁缓铺于8ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上,离心：2000r/min；5,上层液（弃去）,沉淀,核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，5,上层液（弃去）,沉 淀,初步纯化的细胞核,5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核,待测样品,鉴定,实 验 流 程 图,2鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:,1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：,（2）核糖核酸的鉴定,混合各管,沸水浴(10),冷却,加入5%三氯醋酸(8ml),搅匀后离心,2000r/min；5,上清液,立即混合各管,沸水浴(10),冷却,比较各管颜色,2鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:,1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：,（3）脱氧核糖核酸的鉴定,混合各管,冷却,离心,上清液,立即混合各管,冷却,比较各管颜色,2000r/min;5,表1.核糖核酸的鉴定,表2.脱氧核糖核酸的鉴定,1规范操作，防止滴管、试剂的污染。细核悬液的平铺要轻柔；浓酸的取用要小心；使用离心机注意平衡，转速从低到高；,思 考,1.本实验结束后若想继续测定肝脏中DNA、RNA的含 量，可用什么方法？,2.我们已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请问 我们是否可以用这两种方法分离DNA、RNA？若能，请简单叙述其原理。,实验七 血糖测定（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法）及肾上腺素对血糖浓度的影响1.血糖的来源与去路？2.激素对血糖的调节？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.实验原理及操作步骤。,下次实验预习内容,生物化学设计性实验安排经讨论决定，本学期第八次实验是设计性实验，也作为实验考核内容，占实验总成绩的30%（共9分）。一.内容：牛血清白蛋白的提取与鉴定二.设计方案的要求和时间：要求每大组1份，写明实验目的、实验原理、操作步骤或流程、仪器和试剂、预测结果、参考文献或资料等项目。于第七次试验前完成，第七次实验时交给相应实验室的实验教师。实验设计成绩4分（科学合理3分、可操作性1分）三.实验实施的时间和要求：按最后一次实验的时间安排，分班按课程表进行实验，要求每人独立完成实验操作并当堂完成实验报告。实验操作成绩3分（基本操作1分、试剂盘整理有序1分、实验环境卫生1分）实验报告成绩2分（目的原理0.5分、操作流程0.5分、结果0.5分、分析讨论0.5分）生物化学实验室 2010年11月15日,