实验八动物细胞融合.ppt
实验八 动物细胞融合,一、实验目的,了解细胞融合的原理 初步掌握聚乙二醇法诱导细胞融合的实验 方法。,二、实验原理,细胞融合又称体细胞杂交是指在自然条件或利用人工方法（生物的、物理的，化学的），使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。利用人工诱导方法，不仅可以使同种细胞发生融合，而且可以使不同种间细胞发生融合。,种内杂交细胞（intraspecific hybrid cell）:同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞（interspecific hybrid cell）:不同种的细胞融合而成的细胞,人工诱导细胞融合,病毒诱导融合 化学诱导融合 电激诱导融合,1、病毒诱导融合,很多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒等。这类病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。融合率较高，对各种动物细胞都适宜。但是病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。,2、化学诱导融合,很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷酸酰丝氨酸等。这类物质导致细胞膜脂分子排列的改变，在去除作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中由于接口处双分子层质膜的相互亲合和表面张力，使相接触的细胞发生融合。使用方便，诱导细胞融合的频率比较高，效果稳定，适用于动植物，但是具有毒性。,3、电脉冲诱导融合,发展于20世纪80年代，在高频交变电场作用下,细胞发生极化作用形成偶极子,受电场力的作用进而沿电力线方向运动彼此粘连成串;对成串细胞施加瞬时高压脉冲,质膜在高电压作用下发生瞬时可逆性的电穿孔,进而发生细胞的融合。具有融合频率高、无毒性、作用机制明确、可重复性好等优点。难控制一对细胞间的融合。,4、激光诱导融合,利用激光俘虏法或者低浓度的融合剂PEG(5%)发使细胞聚集，然后利用激光微束可以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏,从而诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。具有控制性好、融合频率高、无毒性、作用机制明确、可重复性好等优点。,聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）法的原理：PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。,无色无臭粘稠液体至蜡状固体。溶于水、乙醇和许多其他有机溶剂，具有良好的水溶性,无毒、无刺激性.品种多，聚乙二醇300(PEG300)、聚乙二醇600(PEG600)、聚乙二醇20 000(PEG20M)，PEG后面数字表示平均分子量,在医药、纺织、化妆品工业中 广泛应用,动物细胞融合影响因素,动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。亲本细胞表面性质影响较大细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导-腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34振摇则融合率下降。在37时不振摇则-不融合。,细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L。最适合的pH为之间，在此范围之外，融合率均较低。,细胞融合成功的关键：细胞活力、离子浓度、pH值、充足的氧和适当的诱导物等。,三、细胞融合的应用,动物和植物的不同种、属之间的细胞可以融合，并且动植物之间的细胞可以融合，从而培养成各种性状的杂种细胞。细胞融合被广泛应用于研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、研究肿瘤发生机制等领域。,四、实验材料、设备,鸡血红细胞悬液、GKN溶液、0.85生理盐水、50PEG溶液、0.6M蔗糖溶液光学显微镜、离心机、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、移液器、离心管、吸管等GKN溶液:8gNaCl+0.4g KCL+1.77g NaH2PO4.2H2O+0.69g Na2HPO4.12H2O+2g葡萄糖+0.01g酚红，加水至1000ml,本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。,PEG 融合实验步骤,鸡红血球的洗涤：每人取用0.9%生理盐水稀释100倍的鸡血1ml于1支Ep管中，以1000r/min离心3min，去上清；再依次用1ml生理盐水和1ml GKN溶液各洗一遍（洗涤离心）加0.5mlGKN悬浮细胞（10-12滴）。37 水浴锅中温育5min。PEG(含5mM CaCl2)温育：再缓慢滴加预热的50PEG 0.25ml，边加边混匀,于37水浴锅中温育20min。洗涤细胞：加GKN溶液1.0ml稀释,以1000r/min离心3min，去上清，再用0.5ml GKN溶液重悬细胞观察：滴片(上盖玻片)，显微镜观察，画图。,1.在显微镜下观察细胞融合情况，可看到不同融合状态的细胞：两细胞的细胞膜间相互接触、粘连；接触部位的细胞膜崩解，两细胞间的细胞质相通，形成细胞质通道；通道扩大，两个细胞连成一体；细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。,实验结果及分析,注意事项,1.滴加50PEG时，应缓慢、逐滴加入，而且每 加一滴应轻摇离心管以混匀，滴加完毕后可用 滴管温和混匀。2.高Ca2+浓度能提高细胞的融合率。3.因PEG对细胞有毒性，应严格控制作用时间为1-2分钟，但本实验中融合后的细胞不继续培养，可将处理时间延长至15min以达到最高融合率。4.细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度应控制在3739范围内。,作业,绘细胞融合过程图。,
