实验二胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定.ppt

实验二 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（P40）,一、实验目的,（1）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方法；（2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性测定的原理和方法；（3）掌握离心机和微量移液器的使用方法。,二、实验原理,胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的蛋白质。利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中抽提胰蛋白酶抑制剂，利用盐析使胰蛋白酶抑制剂沉淀出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进行跟踪检测。,二、实验原理,胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰-L精氨酰-对硝基苯胺(BAPNA)，使BAPNA发生水解，生成苯甲酰-L-精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶色。如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解，无对硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，并测定其抑制活性。,二、实验原理,BAPNA BA p-NA,三、试剂与仪器,（一）试剂0.2 mol/L Na2HPO4，0.2mol/L NaH 2P04。0.8mol/L磷酸缓冲液；36mL 0.2mol/LNa2HP04与14mL 0.2mol/L NaH2PO4混合，用蒸馏水定容到500 mL。固体硫酸铵。2 mol/L HCIl0mol/L NaOH。60乙酸溶液(v/v)。底物缓冲液：0.1 mmol/L pH值8.1 Tris-HCI缓冲液(内含0.4的氯化钙)。1 mmol/L BAPNA水溶液.20 mg/mL胰蛋白酶溶液：用0.001mol/L盐酸配制。,三、试剂与仪器,（二）材料与器材新鲜材料绞碎机纱布台式高速冷冻离心机微量移液器pH值试纸恒温水浴锅电子天平玻璃试管、烧杯、量筒离心管,四、实验方法,（一）胰蛋白酶抑制剂的提取和纯化,50g大豆，绞碎，1：7加水,pH5.0，4，过夜,缓慢加入硫酸铵至60%饱和度,10ml，2500rpm，15min,取1.5mL上清，10000rpm，10min,静置0.5h,弃沉淀留上清，调pH7.0，测体积V，计算硫酸铵量,纱布过滤,留沉淀，加入200L dH2O,胰蛋白酶抑制剂水溶液,（1）取两支试管，分别标记记号，其中1号管为对照管，2号管为测试管。（2）按照(表2-1)表格所示数据将溶液分别加入两支试管中。（3）将试管中的溶液摇匀，放入28水浴2 min。（4）向两支试管中各加入0.2 mL 20 mgmL的胰蛋白酶溶液，摇匀。（5）28水浴5 min。（6）向两支试管中分别加入0.4 mL 60的乙酸。观察现象。,四、实验方法,（二）胰蛋白酶抑制剂的活性测定,五、结果与分析,说明现象解释原因,六、讨论与心得,试分析实验过程中影响胰蛋白酶抑制剂分离提纯效果的因素有哪些？实验心得及改进意见。,