实验二细胞培养的基本知识和准备.ppt

实验二、细胞培养的基本知识和准备,为什么要进行细胞培养,高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（invivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（invitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cellculture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。,细胞培养的优点,1.便于应用物理、化学、生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律；2.便于应用各种不同技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化；3.可以长期研究和观察细胞遗传行为的改变；4.可以提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。,第一部分.细胞培养的基本知识,（一）培养细胞的类型及其特点,体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据其生长方式（即根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性）可分为贴附型和悬浮型两大类。,（1）贴附型,大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，细胞形态仅大致分成以下四型：,体外培养贴附型细胞形态,1、成纤维样细胞：胞体多呈梭形或柳叶形或不规则三角形，且具有长短不等的数个细胞突起。中央有卵圆形核，其生长时一般不会紧靠连接成片，而是排列呈涡旋状、放射状，或似栅栏状。,成纤维细胞,培养细胞的类型及其特点,贴附细胞型MRC-5成纤维细胞,2、上皮样细胞：细胞多呈扁平三角形或不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。皮肤表皮以及消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,上皮样细胞,3、游走样细胞：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,(2)悬浮型,少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。,培养细胞的生长和增殖过程,培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（life span）指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。,1原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。一般持续1-4周。,2传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。,3衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line,培养细胞一代的增殖过程,培养细胞的一代生存期，一般可被分为三个阶段。潜伏期对数生长期停止期（平台期）,潜伏期（Latent Phase）：,潜伏期（Latent Phase）：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。,潜伏期1.悬浮期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,2.贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期待细胞贴附于支持物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细胞进入生长和增殖期还有一定时间，称为潜伏期（latent phase）。此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。,过程:游离期:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形吸附期:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏期:可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相,原因:,操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤。接种细胞:适应，恢复，积累(代谢中间产物)组织块:细胞迁移出一般经数小时-几天,影响因素：,滞留期的长短与：细胞种类按种的细胞密度培养条件等因素有关,1.细胞密度接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长2.细胞类型传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为6-24h;原代24-96h或更长。单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长 成体:长,3.细胞机能状态 不良者慢4.培养条件培养液,pH,底物不利:污染,有毒,对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结束和对数生长期（logarithmic growth phase）的开始。细胞数随时间变化成倍增长，细胞增殖旺盛，活力最佳，细胞群体均一，是理想的实验用细胞，最适合进行实验研究。此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。,正常贴附型细胞的特点,接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡,传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,特点,(1)细胞数量：细胞达饱和密度，出现密度抑制。停止生长原因:细胞数量多、生长地区占满、营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长。即使经常更换培养液，细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡唯有进行传代方可缓解。,(2)细胞活动小,细胞膜的活动小(3)生长组分下降:010%(4)及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况,肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。,（二）细胞培养基本条件,1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。,培 养 基,培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）,支原体污染,支原体污染后，不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等,清除支原体的常用方法,抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时更换所有培养用物。通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。,一种简单的原核生物。0.2-0.3m，对热抵抗力差，通常55经15分钟处理可使之灭活,2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分,3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。,4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。动植物不同。5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。,培养基类型,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。（一）天然培养基：类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：1.来源受限。2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。3.易发生支原体（最小的细胞）污染,（二）合 成 培 养 基,概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分:氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点:缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血清)。,血 清 的 成 分血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有以下成分：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；各种生长因子；转移蛋白；不明成分。血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,合成培养基中血清的加入量：一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,血清的灭活（消除补体活性）：56，30 分钟。补体参与反应有：细胞毒作用,平滑肌细胞收缩,肥大细胞和血小板释放组胺,增强吞噬作用,促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化 血清的消毒：过滤除菌。（绝大多数细菌的直径大小在0.55m之间）血清的保存：-5度至-2O度。若存放于4度时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议将无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。血清的解冻：逐级解冻，-2O度至-4度至室温,切勿直接将血清从-20进入37解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。,1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系（CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以及BHK21 细胞等）在无血清培养基中成功地生长和增殖。应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,无 血 清 培 养 基,无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,抗 菌 素 的 使 用抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。破坏细菌的细胞壁，庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定，,青霉素：革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、螺旋体、梭状芽孢杆菌、放线菌以及部分拟杆菌有抗菌作用 链霉素：抗菌素的一种。白色粉末，有苦味，对结核杆菌、鼠疫杆菌、大肠杆菌等有抑制作用 庆大霉素：革兰氏阴性菌,完全培养基的组成,基础培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升CO2培养箱（维持溶液的pH）,培 养 基 的 配 制,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位/毫升 加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2，加血清至终浓度为 10。,碳酸氢钠的作用,碳酸氢钠，通过跟二氧化碳的作用来维持培养液的pH值。碳酸氢钠:2g/L,即（2/84(分子量)）mol/L=0.024mol/L.正常血浆中HCO3-和H2CO3的浓度分别约为0.024 molL-1和0.0012 molL-1，pH的正常值应在7.357.45之间。,Henderson-Hasselbalch方程,pH=pKa+lg,HCO3,H2CO3,=6.1+1.3=7.4,人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低，(万分之2-3)，如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养，培养液中的pH发生变化，这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养，还是需要二氧化碳培养箱。,HEPES的使用,HEPES（分子量238.31）一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L细胞培养瓶盖离开培养箱则需拧紧，以保证CO2气体不迅速逸出,酚红的使用,酸碱指示剂低于6.5:柠檬黄 6.5:黄色 7.0:橘红色 7.4:红色 7.6:桃红色 7.8:紫红色,1.培养液 按照细胞生长情况，选择最适合的培养液；摸索需要补加的成分及添加量；培养体系的酸碱度；适当换液。2.培养空间 培养液体与液体上方的空间的体积比为 1:10为宜。液体的高度最好维持在 2-5mm，以便于气体交换 3.严格的无菌无毒操作,细胞培养注意事项,细胞培养失败原因,培养条件供体本身,第二部分.细胞培养前的准备,一、培养用具的清洗,（一）玻璃器皿的清洗,玻璃器皿在培养过程中用量大，重复使用频率高，要求严格清洗，特别是与细胞直接接触的各种培养器皿，即使含有微量的化学物质，都会对细胞生长不利。有害物质包括：解体的微生物、细胞残留物以及非营养成分的化学物质玻璃器皿的清洗一般包括浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤。,1.浸泡,目的：软化器皿表面附着的物质，同时清除玻璃因为生产工艺而残留的碱性物质和其他有害物质。方法：一般是在清水（或加有洗涤剂）中浸泡数小时，再经简单的刷洗，然后在5稀盐酸溶液中浸泡12 h 以上。注意：污染的瓶子或者培养肿瘤细胞的瓶子，要在2来苏尔中浸泡过夜。来苏尔为甲酚、植物油、氢氧化钠的皂化液，含甲酚50%。无色或黄色液体,2.刷洗,目的：去除表面杂质方法：使用软毛刷，将浸泡后的器皿在洗涤剂中反复刷洗，用力要轻。忌用粗糙的工具抠刮器皿的表面，以免损伤表面并且造成划痕。刷洗不要留下死角。刷洗结束后，用自来水充分冲洗，晾干。,3.泡酸（浸酸）,目的：利用洗液的强氧化性，去除器皿表面可能存在的有机物。新的或者重复使用的器皿一般都需要泡酸，一些无法用毛刷刷洗的物品（如吸管等）通常也主要靠泡酸来去除污物。方法：将干燥的器皿（？）完全浸入洗液中，培养瓶、试剂瓶等容器要完全充满酸液。浸泡时间应该在6小时以上，最好过夜。注意安全，防止损伤皮肤、眼睛、衣物！,洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和水配制的清洁液，具有强氧化性和腐蚀性。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，冷却后，慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配成后清洁液一般为棕红色。切记：是酸加入至水中，而非水加入至酸中，否则产生水加入热油的后果 酸缸是用来装硫酸或重铬酸钾与硫酸的混合液、硝酸、盐酸等液体的容器，用来浸泡实验器皿与液体的储存，有玻璃、陶瓷、聚氯乙烯（PVC）等材料做的酸缸,食用油着火时怎么办?,家庭中常用的油，以食用油为主，最常见的是油锅起火。起火时，要立即用锅盖盖住油锅将火窒息，切不可用水扑救。因为油的比重比水轻，浮于水面之上仍能继续燃烧，水往别处流动，会把火势蔓延。也不可以用手去端油锅，以防止热油爆溅、灼烧伤人和扩大火势。如果油火撒在灶具上或地面上，可以用砂土盖上，或用泡沫灭火器、干粉灭火器扑灭，还可以用湿棉被、湿毛毯、湿衣服等捂盖灭火。,电脑、电视机着火 电脑、电视机着火应马上拔下电源，使用干粉或二氧化碳灭火器扑救。如果发现及时，可以在拔下电源后迅速用湿地毯或棉被等盖住电脑。切勿向失火电脑泼水，否则会因为电脑或电视机温度突然下降而发生爆炸。其他电器发生火灾时，首先要切断电源。在无法断电的情况下千万不能用水和泡沫扑救，因为水和泡沫都能导电，应选用二氧化碳、1211、千粉灭火器或者干沙土进行扑救，而且要与电器设备和电线保持2米以上距离。,使用过程中要注意防护，操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚胶皮手套，严防洗液对眼睛、皮肤和衣物的伤害和损坏。洗液一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样洗液加热，再加适量重铬酸钾，又可重新使用。,4.冲洗,目的：泡酸后的器皿必须用大量自来水冲洗，以去除残留的洗液。方法：自来水流应该有一定的压力，每件器皿都要反复注满水、振荡、倾空20次。最后用蒸馏水浸洗3次。烘干后包装。,（二）橡胶塞和塑料制品的清洗,细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，使用后的胶塞要先在水中浸泡，再用2的NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗后，再用1稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水各冲洗3次，烘干后包装。,塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。塑料器皿在使用后应该及时在水中浸泡，避免附着的物质干涸而难于清理。自来水冲洗，一般不用刷洗。洗干净的器皿先在NaOH溶液中浸泡过夜，自来水冲洗后，再用1稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水个冲洗3次，烘干后包装。,（三）金属器械的清洗,擦去防锈油，然后用70酒精棉球擦拭，烘干、包扎、灭菌滤器先用自来水冲净，蒸馏水冲三次，70酒精擦拭，烘干，加滤膜，包装，灭菌,二、清洗后物品的包装,目的：洗净烘干的物品应该及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品便于消毒和贮存，同时可以防止消毒灭菌后再次受到污染。方法：包装常使用牛皮纸、硫酸纸、纱布、棉布、铝箔、铝盒、搪瓷杯、金属消毒筒等。,三、培养用品的消毒和灭菌,（一）物理方法,1.紫外线（ultraviolet）消毒原理：紫外线可以破坏微生物的蛋白质和核酸，从而杀灭多种微生物，其中革兰氏阴性菌最为敏感，其次是革兰氏阳性菌，再次是芽孢，真菌孢子抵抗力最强。用途：直接照射空气、地面、工作台表面。优点：用法简便，效果好。,注意事项：紫外线的消毒效果和光源的辐射强度、照射时间成正比。灯管距离地面2米左右。用30w的紫外灯照射9平方米的房间，每次照射23小时。紫外线照射工作台面的距离应该小于1.5米，时间30分钟左右。紫外线照射效果的影响因素：温度（适合温度10-20度，室温低于10，则辐射强度显著下降）湿度，（不超过50%，影响小，湿度达到80%90 时，辐射强度显著下降）空气要清洁，空气含尘率越高，灭菌效果越差 不能穿透纸张、布等遮挡物 场地和台面经过擦拭后照射效果更好 紫外灯管的使用寿命,2.高温干热灭菌,原理：用电热烤箱内160以上的高热，保温90-120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌的目的。适用：不便于在蒸汽压力灭菌锅中进行灭菌且不会被高温损坏的玻璃器皿（如体积较大的培养瓶、烧杯等）、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品（粉剂、油剂）。橡胶制品和塑料制品不能使用干热消毒法。,注意事项：温度和时间要达到要求。灭菌结束，切忌不要急于开门，应等温度下降冷却后再打开，防止玻璃器皿因为温度骤变而破裂。物品之间应该留有空隙，便于热空气的流动。烧灼：也是干热灭菌的方法之一。在培养操作中，常常利用操作台上酒精灯或者煤气灯的火焰对金属器皿及玻璃瓶口进行补充消毒。,3.压力蒸汽灭菌,原理：通过高温高压和蒸汽良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而死亡。适用：最常用的灭菌方法，布类衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞、某些培养液体都可以使用该方法灭菌。,注意事项：1.保证灭菌锅内有水；2.物品不要超过消毒筒体积的80，物品之间要留有空隙，液体容器应该在瓶塞上插入一个5#或者7#针头，或者在玻璃塞和瓶口间夹一个纸条，以平衡内外的气压；3.水沸腾后，应该排气15分钟；4.将需要的压力维持一定的时间。5.排气要缓慢进行，尤其有液体存在时；,不同压力蒸汽所达到的温度,高压灭菌一般采用1212030 min。,4.过滤除菌,原理：将液体或者气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒被阻留，从而达到除菌的目的。适用：用于遇热容易发生变性而失效的试剂或者培养用液，如人工培养基、小牛血清、胰蛋白酶等。分类：负压过滤和正压过滤。正压过滤具有流速高、过滤快、不易污染。避免形成气泡等优点。滤膜直径25mm的针头滤器，适合过滤100ml以下的少量液体。,5.煮沸消毒法,紧急情况下常用的方法，将金属器械、胶塞、注射器等在水中煮沸20-30分钟，趁热倒去水即可使用。,6.电离辐射灭菌,原理：以放射性核素（如60Co）产生的射线或者电子加速器产生的加速粒子照射物品以达到杀灭细菌等微生物的方法。适用：金属、塑料橡胶、玻璃陶瓷、人工医学制品等。许多一次性器械和用品，如培养器皿、培养板、注射器、移液器吸头、离心管等，都可以用辐射灭菌。优点：1.处理过程中不升温，对于不耐热的物品尤其适用；2.射线的穿透力强，紧密包装的物品经过灭菌后可以长期存放。需要专门的设备和专人指导、操作。,（二）化学方法消毒,利用化学消毒剂来对那些物理方法难以奏效的物品、场地、皮肤等进行消毒。常用的有乳酸、甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯己定、戊二醛、碘伏等。此外市场上适用的化学消毒剂，如“84”等，均可以用于地面、台面的消毒。,1.乳酸,使用方法：ml/m3）放入甘锅中加热熏蒸，时间30分钟。空气灭菌。分子式是C3H6O3，CH3CHOHCOOH。,2.甲醛（methyl aldehyde）,甲醛是广谱灭菌剂，水溶液和气体。对于各种细菌、芽孢和真菌都有杀灭作用。使用方法：1.多聚甲醛加热法。将多聚甲醛研成粉 末，均匀铺开在金属板上，加热到 150以上就会产生甲醛气体。用量 10-20g/M2，时间12-24h 2.福尔马林加热法：将40的甲醛溶液（福尔马林）在蒸发皿中加热蒸发。用量25ml/M2，时间12-24h,3.氧化法：将高锰酸钾（或者漂白粉）放入一个平皿内，倒入甲醛溶液，即可释放出甲醛气体。甲醛溶液的用量：40ml/M2，高锰酸钾30g/M2，时间12-24h甲醛熏蒸注意事项：甲醛气体的穿透力差，熏蒸前应该暴露物体表面，打开橱门，摊开或者挂起物品。温度18，湿度70。甲醛对人有害，应该等气体散净后再进入室内工作。,3.环氧乙烷（ethypene oxide）,具有广泛的杀菌作用，不损害物品，穿透力将。用途：消毒塑料制品以及不耐高温、不耐潮湿的物品。（塑料培养瓶、培养板、布料等）方法：将物品放置于灭菌袋中，充入环氧乙烷气体，10分钟后，再充满一次。于25-30维持12h。注意：环氧乙烷易燃易爆，有毒，注意防火。不可用于空气消毒。在空气中浓度超过3可引起燃烧爆炸。因本品可导致红细胞溶解、补体灭活和凝血酶原破坏，不能用作血液灭菌,4.煤酚皂溶液（来苏尔为甲酚、植物油、氢氧化钠的皂化液，含甲酚50%。无色或黄色液体）,甲酚抗菌作用较苯酚强310倍，而毒性几乎相等，故治疗指数更高。2溶液经1015min能杀死大部分致病性细菌。由于在水中溶解度低，常配成甲酚皂溶液。安全使用：对粘膜和皮肤有腐蚀作用，因此需稀释后应用，误服可致死。12%溶液用于手消毒，35%溶液用于器械物品消毒，510%溶液用于环境、排泄物的消毒。对一般致病菌，效果好，对芽孢则需高浓度长时间才有杀菌作用。来苏 2溶液刷洗地面、桌凳墙壁、天花板。,5.新洁尔灭：（苯扎溴铵/溴化苄烷铵，十二烷基二甲基苄基溴化铵）1溶液刷洗地面、桌凳墙壁。6.过氧乙酸：氧化能力极强，0.5浓度10分钟就可将芽孢菌杀死，可以对各种物品的表面消毒，使用时用水稀释，喷洒和擦拭均可,5.乙醇（ethanol）,广泛应用的消毒剂，效果可靠，对其他灭菌剂如戊二醛、碘伏、氯己定等有增效或者协同作用。挥发性好，常用于需要快速发挥作用而不必长时间等待的消毒。手、手术野、台面、物体表面等等。先将手用肥皂和流水洗3次，用70-75乙醇浸泡5分钟。操作中手或者器械等触及怀疑有污染的物品后，用酒精棉球擦拭消毒。动物的体表用碘酒（碘酒由碘、碘化钾溶解于酒精溶液而制成）消毒后，用70的酒精消毒2-3次，每次20-30秒钟。70酒精可以用来消毒台面、桌面、仪器和物品的表面。乙醇不能杀死芽孢；会使长期浸泡于酒精的橡胶和塑料制品变硬；取材的物品不宜用乙醇浸泡。,6.氯己定（hibitane）,广谱杀菌剂。毒性低，刺激性小，不产生耐药性，主要用于皮肤及创面的消毒。1，6-双（N1-对氯苯基-N5-双胍基）己烷为表面活性剂型杀菌剂，具有相当强的广谱抑菌、杀菌作用，对革兰阳性菌及阴性菌均有效,0.02的水溶液用于手部消毒（浸泡3分钟）及动物创面的消毒，0.5乙醇溶液（70配制）用于擦手消毒和动物取材时皮肤的消毒。耳鼻喉科用药。本品可作为牙龈炎、冠周炎、口腔粘膜炎等所致的牙龈出血、牙周肿痛及溢脓性口臭、口腔溃疡等症的辅助治疗用药。,7.戊二醛（glutaraldehyde）,广谱高效的灭菌剂，具有水溶液稳定，对金属腐蚀性小，低毒安全等优点。2戊二醛碱性稀释液：2（v/v）的戊二醛水溶液中，加入0.3（w/v）的NaCO3，pH7.5-8.5，另外加入0.5亚硝酸钠可以防锈和增效。对金属、温度计、橡皮、塑料管等浸泡30min就可灭菌，然后用水冲净。,8.碘伏与碘酊,碘伏（iodophor）：PVPI，快速杀死细菌、芽孢、真菌、病毒等。用于手部消毒和手术野的消毒。碘伏是单质碘与聚乙烯吡咯烷酮（Povidone）的不定型结合物，对伤口无刺激性。碘酊（碘酒）：2（w/v），用于手术皮肤消毒，消毒后需要用酒精脱碘。为了减少碘对皮肤的长期刺激，一般在用碘酒消毒后，用75%的酒精脱去碘。,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,二氧化碳培养箱,二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，如稳定的温度（37C）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：）、较高的相对饱和湿度（95%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置,使用注意事项,1）操作盘上的任何开关和调节旋扭一旦固定后，不要随意扭动，以免影响箱内温度，CO2、湿度的波动，同时降低机器的灵敏度。2)所加入的水必须是蒸馏水或无离子水，防止矿物质储积在水箱内产生腐蚀作用。每年必须换一次水。经常检查箱内水是否够。3)箱内应定期用消毒液擦洗消毒，搁板可取出清洗消毒，防止其它微生物污染，导致实验失败。4)定期检查超温安全装置，以防超温。,血球计数板计数法原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的细胞计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的细胞悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的细胞数目来换算成单位体积内细胞总数目。,血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区,血球计数板的使用,将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm2;.体积为0.1mm3（ul）,放大后的方格网计数室,中央的一大方格作为计数用，称为计数区,计数室通常有两种规格：,一种是1625型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是2516型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由1625=2516=400个小方格组成。每小格的体积是1/400 mm3。,细胞浓度计算,11625型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL=（100个小方格细胞总数/100）40010000稀释倍数,细胞浓度计算,22516型的计数板 中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数1mL（80个小方格细胞总数/80）40010000稀释倍数,实 验 部 分,器材：5ml枪头15支、培养瓶4只、10ml烧杯1只、25ml烧杯1只、25ml三角瓶1只、培养皿1套、中号镊子1只、小镊子1只、胶塞4+1只、剪刀1把、饭盒1个、脱脂棉少许、裁纸刀1把、纱布1块、2ml管2个、1.5ml管3个包装：中镊/小镊/剪刀 1套 烧杯 大（塞纱布），小 胶塞 4个 培养皿 1套包锥瓶 个封口 培养瓶 封口 1份1个 1份3个/包 枪头 塞好棉花 单独包，然后30支一大包 2ml、1.5mlEP管 1份1个 标记：饭盒、瓶大小包、组号、姓名（1组2人）,饭盒,232各种瓶皿的清洗,3.哪些物品适合于高压灭菌，哪些物品不适合于高压灭菌并说明理由,实验报告内容,1.总结细胞培养条件和注意事项,