实验3质粒DNA的提取与鉴定.ppt

质粒DNA的提取、定量酶切与鉴定,http:/,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology,尹莉,实验内容,提取原理操作步骤,计算方法操作步骤,质粒DNA,定量,酶切原理酶切步骤,酶切,电泳原理电泳步骤,电泳,实验目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作,第一部分 质粒DNA提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA,独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多,质粒（lasmid）,定 义,碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等,方 法,选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求,分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA,分离质粒DNA三步曲,分离质粒,收集裂解细菌,质粒扩增,基本步骤,基本原理,1、碱裂解法,基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；,高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；,当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；,原理示意图,2、离心层析柱,基本原理,硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5（三）试剂：LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）,溶液 P1 溶液 P2溶液 P3 去蛋白液 PE漂洗液 WB洗脱液 EB,仪器材料,50mmol/L 葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块,溶液 I,0.2 mol/L NaOH1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次,溶液 II,5mol/L 乙酸钠60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线性DNA沉淀，Na可中和DNA注意：复性时间不宜过长,溶液 III,菌液,离心12000rpm,1min,弃上清,短时离心,彻底弃上清,加250l 溶液P1,旋涡振荡,悬浮沉淀,加250l 溶液P2,加400l 溶液P3,颠倒,颠倒数次,放置3-5min,离心13000rpm,10min,取上清700l加到吸附柱中,离心,13000rpm,1min,弃滤液，加入500l去蛋白液,13000rpm,1min,离心,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,（6）,（7）,（8）,（9）,弃滤液，加入500l漂洗液WB,（10）,离心,13000rpm,1min,弃滤液，加入500l漂洗液WB,（11）,离心,13000rpm,1min,弃滤液,（12）,离心,13000rpm,2min,放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加70l洗脱液EB,离心,13000rpm,1min,（13）,-20保存备用,操作步骤,第二部分 酶切鉴定DNA Restriction Enzyme Digestion,在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂,移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37水浴1.5h,反应体系,限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。,限制性内切酶,限制酶的切割点因酶而异，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoR.,限制性内切酶,平末端在识别顺序的中心对称轴处切割,5 G-G-C-C 33 C-C-G-G 5,5 G-G3 C-C,-C-C 3-G-G 5,限制性内切酶,3端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3末端切割。,5 G-G-T-A-C-C 33 C-C-A-T-G-G 5,G-G-T-A-C 3 C,C 3 C-A-T-G-G,限制性内切酶,5 G-A-A-T-T-C 33 C-T-T-A-A-G 5,G C-T-T-A-A 5,5 A-A-T-T-C G,5端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。,5 A-A-G-C-T-T 33 T-T-C-G-A-A 5,A T-T-C-G-A 5,5 A-G-C-T-T A,限制性内切酶,双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER 如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。,限制性内切酶,Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表,酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 l 反应液中，30温度下反应1小时，将1 g 的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外该酶可分解15g的DNA。,限制性内切酶,插入400bpDNA片段,质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp,酶切片段大小为?,影响酶切反应的因素,底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应;反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应;反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%;保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;,限制性内切酶,紫外光吸收法,原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的 3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.,定量检测,计算方法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。,定量检测,记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒DNA(g/ml)=50(OD260)稀释倍数,注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.,定量检测,根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280）,Ratio=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求Ratio1.9 RNA污染Ratio1.6 有蛋白质或其它杂质的污染,定量检测,实验仪器,定量检测,紫外分光光度计,比色杯,数据处理,定量检测,菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原 因,对策,常见问题,混有蛋白混有RNA混有基因组DNA,不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质加入RNaseA室温放置一段时间加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对策,常见问题,定量检测,第三部分 琼脂糖凝胶电泳DNA Agarose Gel Electrophoresis,天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,定 义,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).,实验原理,1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响,影响迁移速率因素,分离范围,.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。Gelview TBE琼脂糖5、DNA Marker 5000,实验材料,溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.,常用染料,实验材料,是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。,DNA Marker,应选择在目标片段大小附 近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,实验材料,电泳缓冲液,4 保存备用,实验材料,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,实验步骤,加样量质粒DNA：10*loading buffer+4l酶切产物：10*loading buffer+2l用移液枪吹打混匀（避免产生气泡）后各取10l点样点样要集中、迅速，否则样品会挥发，影响成像每组点两种样品：质粒DNA和酶切产物两条带每组记清自己点样的位置,倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Geldview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久,注意事项,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,5000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp,M:DL5000 DNA Marker1,4,7,10 为PCR目的条带;2,5,8,11 为质粒3,6,9,12为酶切片段,酶切长片段,含目的DNA片段的酶切短片段,实验结果,思考题,碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？影响PCR的主要因素有那些?,