外源化学物质突变作用.ppt

第五章 环境化学物的致突变性及其评价,2,环境毒理学,第一节 环境化学物的致突变性及其评价 一、基本概念生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为变异（variation）。基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变（mutation）。突变的发生及其过程就是致突变作用（mutagenesis）。突变可分为自发突变(natural或sporadic mutation)和诱发突变(induced mutation）。各物种的自发突变频率较低,而诱发突变比较常见,诱发突变指由于物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至今,已发现相当数量的外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱变剂（mutagen），也称为遗传毒物(genotoxic agent）。,3,环境毒理学,环境化学诱变剂的分类第一 组 人工合成,仅在一定条件下应用的诱变剂 1.药品 抗癌药抗菌素,麻醉药和避孕药等 2.农药 杀虫剂,灭鼠剂,除莠剂和除霉剂等及他们的残留物 3.食品添加剂 4.化妆品 5.生物污染第二组 工业生产中应用的或产生的环境诱变剂 1.工业烷化剂 2.有机溶剂及有机金属化合物 3.水污染物 4.空气污染物 5.重金属及其化合物第三组 自然界存在的诱变剂与食品加工过程产生的诱变剂 1.生物碱 2.微生物代谢产物 3.食品加工过程中产生的诱变剂,4,环境毒理学,二、突变的类型 一般根据遗传物质的损伤能否在显微镜下直接观察到分为染色体畸变(chromosome aberration)和 基因突变(gene mutation)两类：染色体损伤大于或等于0.2微米时，可在光学显微镜下观察到，称为染色体畸变；若小于这一下限，不能在镜下直接观察到，要依靠对其后代的生理、生化、结构等表型变化判断突变的发生，称为基因突变(gene mutation），亦称点突变(point mutation）。,5,环境毒理学,6,环境毒理学,7,8,9,化学毒物致突变的类型,(一)、基因突变(gene mutation)1碱基置换(basepair substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。(DNA碱基被其他碱基所取代)碱基：腺嘌呤（A,Adenine)鸟嘌呤（G,Guanine)胞嘧啶（C,Cytosine)胸腺嘧啶（T,Thymine)A-T;G-C,三个碱基对构成一个密码子转换(transition)颠换(transvertion),10,它包括转换和颠换两种情况：原来的嘌呤被另一嘌呤置换或原来的嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转换(transition）；若原来的嘌呤被嘧啶置换或原来的嘧啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换(transversion）。无论是转换还是颠换都只涉及一对碱基，其结果可造成一个三联体密码子的改变,可能出现同义密码、错义密码和终止密码。由于错义密码所编码的氨基酸不同，表达的蛋白质可能发生改变；如果错义密码为终止密码，可使所编码的蛋白质的肽链缩短。,11,(一)、基因突变(gene mutation),化学毒物致突变的类型,12,化学毒物致突变的类型,(一)、基因突变(gene mutation),13,2移码突变(frameshift mutation)指发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。3、大段损伤 大片段损伤是指DNA链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到的染色体变化，故又可称为小缺失。,14,(二)、染色体畸变(chromosome aberration)指染色体的结构改变 染色单体型畸变(chromatid-type aberration)染色体型畸变(chromosome aberration),化学毒物致突变的类型,15,（1）裂隙和断裂（gap and brake）：都是指染色体上狭窄的非染色带，其所分割的两个节段保持线状连接为裂隙，否则为断裂。（2）无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，且这些断裂的节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有丝粒的异常染色体。细胞再次分裂时会形成微核或微小体。（3）环状染色体（ring chromosome）：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接成一个环，称之为环状染色体。（4）倒位(inversion)：当染色体发生两次不同部位断裂时，中间节段倒转1800再重接，为倒位。（5）插入和重复(insertion and duplication)：当一个染色体发生三处断裂，带有两断段的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接称为插入，若缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，则出现两段相同节段，称为重复。（6）易位(translocation)：从某个染色体断下的节段连接到另一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一个节段连到另一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，若发生3处以上的断裂，其交换重接称为复杂易位。,16,染色体缺失及环状染色体的形成图,染色体插入和重复示意图,17,染色体的臂间倒位,染色体相互易位示意图,18,(二)、染色体畸变(chromosome aberration),化学毒物致突变的类型,19,(三)、基因组突变 1非整倍体 非整倍体(aneuploid)指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体(monosome)，增加一条染色体时称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2整倍体 整倍体(euploid)指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在人体，3n为69条染色体，4n为92条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。,化学毒物致突变的类型,20,致突变作用的机制,三 致突变作用机理一、DNA损伤与突变1.碱基错配(共价结合)2.嵌入DNA链3.碱基类似物的取代4.碱基的化学结构改变或破坏,21,二、DNA损伤的修复 遗传信息之所以能长期保持高度保真(fidelity)即重现精度，是由于细胞能够:通过对DNA损伤的修复以保护亲代DNA链，使之避免由于外来因素的作用而发生改变；执行高度保真的复制，即对复制中发生的错误及时修复以达到高度保真性。现已证明突变频率与各种酶性DNA修复和防错系统的效率呈负性相关。但也有一些是易错(error-prone)修复系统。,22,机体修复DNA损伤的机制可分为两大类：1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA 复制的DNA损伤。2.修复机制：,DNA修复,直接修复,切除修复,O6甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,机体对致突变作用的影响,复制后修复,呼救性修复,23,估计的人类内源性DNA损伤和修复过程,损伤类型 损伤发生率 最大修复速度,脱嘌呤 1 000 a 脱嘧啶 55 a 胞嘧啶脱氨 15 a 单链断裂 5000 2105 N7甲基化鸟嘌呤 3500 a O6甲基化鸟嘌呤 130 104 氧化性产物 120 105,注：损伤发生率以每小时每细胞发生次数计，最大修复速度以每小时每细胞修复的碱基对数计，a指虽已测出实际的值，但估计最大修复速度为发生率的2倍以上,24,1、复制前修复 光复活：最常见的紫外线对DNA的损伤：相邻2个胸腺嘧啶形成二聚体。修复：在长波紫外线或短波可见光诱导下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体化。在人类未得到充分证明。“适应性”反应 低剂量烷化剂可诱导一种专一蛋白质（酶）的合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受体蛋白。可将结合到碱基上（鸟嘌呤）的烷基转移到酶本身的半光氨酸-SH基上，恢复嘌呤本身的结构。多种细胞中存在。,25,切除修复 多步骤修复过程。在多种酶的作用下，将受损伤的碱基或异常核苷酸切除。包括损伤部位识别外切酶、内切酶、连接酶等。能修复UV、加合等多种形式的DNA损伤。2、复制过程中的修复 损伤保留至复制时修复，容易发生错误。有些损伤保留至复制时才得以修复。3-5外切核酸酶，具有校正读码功能，修复复制过程中的错误。3、复制后修复（SOS修复)仅限于原核生物。,26,总之，任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生；如果修复错误或未经修复，损伤就得以固定(fixed)下来,于是发生突变。因此诱发突变是一个受控制的过程，失控才真正发生突变。一般来说从DNA损伤到损伤固定需要几次细胞分裂周期才能形成。,27,突变的不良后果,四、突变的不良后果,28,体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，将在下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能导致畸胎，当然，畸胎的发生还与亲代的生殖细胞突变有关。据报道人类妊娠最初3个月流产中有60%有染色体畸变，在一定程度上这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代生殖细胞突变的后果。体细胞突变也可能与动脉粥样硬化症有关。因为对于正常动脉壁细胞中的葡糖-6-磷酸脱氢酶有两种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下的细胞在电泳中只表现为同一种变异体，故认为动脉粥样硬化斑块是单克隆来源。体外培养的人类非恶性转化细胞，其寿命都有限。这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐渐增高，而有丝分裂逐渐下降，因此可以推测，体细胞突变是衰老的起因，最低限度在体外如此。另外，DNA修复能力缺陷与成熟的早衰老综合征也有一定关系。,29,二、生殖细胞突变的后果 如果突变发生在生殖细胞，无论其发生在任何阶段，都存在对后代影响的可能性，其影响后果可分为致死性和非致死性两种。致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死要纯合子或半合子才能出现死亡效应。如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传病，包括先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及染色体损伤，将使基因库负荷增加。基因库(gene pool)是指一种物种的群体中生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总和。遗传负荷(genetic load)系一种物种群体中每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的水平。,30,五、致突变性评价方法检测外来化学物的致突变性一般通过致突变实验来进行。其目的主要有两点：检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。,31,1、常用的致突变试验(一)细菌回复突变试验(Ames试验),鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株。(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,观察化学毒物致突变作用的基本方法,原理：利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。,32,方法：将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。特点：优点：简便、灵敏、快速（48h）、费用低；检测结果与对动物的致癌性的相符率达约90%。缺点：利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗传信息，仅1/6；微生物的DNA修复系统与动物有差异；微生物无免疫功能。,33,（二）、哺乳动物体细胞突变试验（1）方法原理与微生物突变类似。常用的细胞株：中国地鼠肺细胞V79 中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。,34,V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱的酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。突变细胞：可在此种培养基上生长。,35,(三)微核试验 微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleus test，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,36,观察化学毒物致突变作用的基本方法,(三)微核试验,37,MN,NCE,观察化学毒物致突变作用的基本方法,38,(四)染色体畸变分析(五)姐妹染色单体交换试验（SCE）,观察化学毒物致突变作用的基本方法,39,染色体畸变试验：直接在显微镜下观察染色体结构和数目的改变情况。生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外：CHO细胞:分裂快、数目适中、形态清晰；人类外周血淋巴细胞体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率的变化。,40,试验方法：a.体外培养：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培养24h(CHO)或72h(人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。b.体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。,41,二、常用的致突变试验(五)果蝇伴性隐性致死试验(六)显性致死试验(七)程序外DNA台成试验(八)转基因动物致突变试验(九)哺乳动物细胞基因突变试验,观察化学毒物致突变作用的基本方法,42,三、致突变试验中的一些问题(一)阴性和阳性对照的设立 1阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。2阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,43,三、致突变试验中的一些问题(二)体外试验的活化系统 1哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。2S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。3纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,44,三、致突变试验中的一些问题(三)致突变试验与致癌试验的关系 已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,45,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000g皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,46,三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阳性结果应具有剂量反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,47,致突变试验举例,美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。,48,致突变试验举例,国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为细菌基因突变试验；体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测)。,49,致突变试验举例,我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(1994)中对遗传毒理学试验的要求是：根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验 以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。,