基因操作的主要技术原.ppt
第一章 基因操作的主要技术原理,第二节 凝胶电泳,凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。,1 凝胶电泳,凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。,按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶 竖式/聚丙烯酰胺凝胶两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易,凝胶电泳的种类,基本原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,2 核酸电泳,凝胶的成分和浓度决定能够分离的DNA大小琼脂糖凝胶：相对大的孔道，分离大一些的分子；聚丙烯酰胺凝胶：很小的孔道，分离小的DNA分子，能够分离仅仅相差一个核苷酸的DNA分子。,用途,琼脂糖凝胶：用于DNA和RNA的常规分析聚丙烯酰胺凝胶：常用于小分子核酸和蛋白质分析凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察,取决于核酸分子本身的大小和构型分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。,电泳的迁移率,与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间；,凝胶电泳的分辨力,Separation Range of Agarose,PolyAcrylamide Gels(PAGE),琼脂糖：一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为 常熔点的琼脂糖 低熔点（LMP）琼脂糖,2 琼脂糖凝胶电泳,Agarose gel electrophoresis,LMP琼脂糖 熔点：6265 熔解后，在37 可保持液态数小时；在25 可保持液态约10min,回收DNA分子 在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；,琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1 TAE（TBE,TPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间,使凝胶中的DNA分子可视化,染色是最简单的方法。溴乙锭(EtBr)能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行染色。只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。注意：溴乙锭是非常强的致癌物；紫外光也会灼伤。因此，用于把DNA染成蓝色或绿色，又不需要紫外照射就能看见DNA的非致癌染料，越来越多地被用于实验室研究中。,染色和观察：溴化乙锭（EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）能看到0.05 g的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比,DNA分子大小的估计,如何确定凝胶电泳中片段的大小?最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是：D=a-b(logM)D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。,方法：利用已知大小的DNA片段作标准(marker/ladder),目的DNA片段与之比对、估计。例如：Hind将DNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5的错误率,Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNA,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,Agarose gel electrophoresis,对放射性标记的DNA进行放射性自显影,染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。放射自显影是一个很好的方法。电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。,聚丙烯酰胺凝胶：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）TEMED 过硫酸铵（10）缓冲液：TBE,3 聚丙烯酰胺凝胶电泳,链分离凝胶-SSCP,用于单链分离,可以进行SNP的检测。PAGE原理：SNP:DNA长度相同，仅一个碱基不同；加热后解链后电泳，迁移速度不同。,可以分离1bp的差异用途：测序、AFLP、为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）,核酸测序凝胶,传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。,4 通过凝胶电泳分离染色体,1984年，发明的，分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。,脉冲电场凝胶电泳（PFGE）,脉冲场凝胶电泳原理图,北,南,脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，制备DNA样品与常规方法不同,脉冲场凝胶电泳PFGE工作假说1)DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr）2)DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm）3)电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）,与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,可以分离几千kb的DNA分子。这个长度范围包含许多真核生物染色体分子，包括酵母、许多重要的丝状真菌和原生动物，如疟疾新生虫。因此，能够得到这些生物体染色体的凝胶图谱。,PFGE can resolve large DNA fragments,染色体DNA电泳的用途 1.测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 2.测定基因连锁关系：结合DNA杂交技术，可适合各种生物 3.染色体DNA重排分析 1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物Leishmania,具有其特征性的染色体。PFG便可用于诊断。,方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生。步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合 50、1 h变性 点样 电泳 染色 观察,5 RNA凝胶电泳,2.羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛，点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上，电泳，染色观察,3.甲醛法步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺，点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上，MOPS缓冲液电泳，染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。,6 蛋白质电泳,方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,用于DNA、RNA以及蛋白质的回收方法 1)电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子洗脱到其它介质中；2)滤纸法 核酸凝胶染色，长波紫外光确定位置，在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)，电泳至DNA带全部进入滤纸条，洗脱DNA，纯化、沉淀,7 电泳片段的分离与回收,3)透析袋法切下含DNA带琼脂块，放入透析袋，封口，放入电泳槽，电泳2-3小时至全部DNA离开凝胶块，反向电泳1分钟，取出DNA液，纯化、沉淀。4)冻融法,回收DNA方法,影响回收率的因素 1）DNA分子大小回收率与分子量大小呈负相关；2）乙醇沉淀其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关；3）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。,
