基因操作中大分子的分离和分析-08级.ppt
第二章基因操作中大分子的分离和分析,一、DNA的分离、检测和纯化二、RNA的分离、检测和纯化,一、DNA的分离、检测和纯化,1、DNA的组成与结构2、DNA分子的重要特性3、染色体DNA的分离和纯化4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化5、DNA的琼脂糖凝胶电泳,1、DNA的组成和结构,Watson-美国生物学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖 Crick-英国生物物理学家,曾获1962年诺贝尔生理学-医学奖,1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋模型.发表在Nature,B,A,Z,计算机模拟DNA构型,几种DNA构型比较,DNA双螺旋结构模型,变性(denaturation）:指在温度、pH等因素作用下，DNA分子的氢键受到破坏，双链分开的过程。复性（renaturation)：是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。水溶解性：DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA的依据。,2、DNA分子的重要特性,3、染色体DNA的分离和纯化,真核、原核生物均有，103106 kb用于分离目的基因或基因表达调控因子（启动子（promoter）提供构建染色体载体和染色体基因整合平台,材料准备：使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。大肠杆菌：菌液培养至对数生长期后期 植物：幼嫩的植株或黄化幼苗 动物：肝脏应清除净胆囊,细胞裂解：关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤 细胞裂解缓冲液 100 mmol/L Tris-HCl,pH8.0 100 mmol/L EDTA 250 mmol/L NaCl 防止和抑制内源DNase对DNA的降解,分离和抽提DNA：根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离。提取总DNA只须在细胞裂解液中加入适当的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)或氯仿/异戊醇(24:1)等有机溶液，可使DNA与蛋白质分开。用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相，使其沉淀，离心获得DNA,4、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化,提纯质粒DNA的三个步骤：培养细菌：对数生长期的细菌。收集和裂解细菌：通过离心法收获细菌。细菌的裂解方法有：非离子型或离子型去污剂、有机溶剂、碱变性以及加热处理等。纯化质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳、CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心法等,碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理 由Birnboim和Doly设计并于1979年发表。在碱性条件下(pH12.012.5)线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。,抽提/裂解缓冲液 溶液：灭菌后，4保存 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液：现用现配，室温下使用(pH12.012.5)0.2 mol/L NaOH 1%SDS 溶液：灭菌后，4保存，用时冰浴(pH4.6)5mol/L乙酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 溶液溶液溶液=1 2 1.5,质粒DNA的纯化用苯酚/氯仿抽提去蛋白质杂质 一般先按1:1（V:V）用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)对DNA粗制品进行抽提，然后用1:1（V:V）氯仿/异戊醇(24:1)再次抽提，以除去蛋白质 用无水乙醇沉淀浓缩DNA 按2:1用无水乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH5.2）沉淀DNA。用RNase去除RNA,4、DNA的凝胶电泳 一定电场中，DNA分子的迁移率与所含碱基对数成反比。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖（agarose,线性多糖聚合物）凝胶缓冲液和电泳缓冲液(TBE,pH 8.3)：45mmol/L Tris-硼酸 1 m mol/L EDTA聚丙烯酰胺凝胶电泳 30%丙烯酰胺,Bio-Rab电泳仪电源,水平电泳槽和一些梳子,DNA泳动方向,溴化乙锭(EB)能掺入到双链DNA中，在紫外光下会发出橙红色的荧光。使用浓度：0.5g/ml紫外线波长：254nm 302nm 366nm,DNA泳动方向是从负极向正极.一般使用的电压为5V/cm.,琼脂糖凝胶,Marker-DNA分子标尺,DNA点样孔,1000 bp,2500 bp,5000 bp,15000 bp1000 bp 8000 bp,线性DNA分子,开环DNA分子,影响DNA样品在电泳时泳动速率的因素 与DNA分子量对数成反比 DNA的构象：超螺旋线性开环形SC构型：共价闭合环形DNA(cccDNA)OC构型：开环DNA(ocDNA)L构型：线性分子DNA(LDNA)与电流大小成正比 迁移率与凝胶浓度成反比,二、RNA的分离、检测和纯化,1、RNA的组成与结构特性2、RNA的抽提和纯化3、mRNA的纯化4、RNA的检测5、RNA的电泳检测,1、RNA的组成与结构特性,mRNA:15%rRNA:8085%(28S、18S 和5S)tRNA/microRNA:1520%,2、RNA的抽提和纯化,溶液和用具的去RNA酶处理 RNA酶非常耐高温，即使高温灭菌也不可完全清除其活性。耐热的物品：高温干热灭菌效果最好。微量移液吸头和离心管：0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡后在高温灭菌。电泳用具：专用！用3%H2O2和0.1%DEPC水浸泡，清洗干净。,酚-异硫氰酸胍抽提法（TRIZOL试剂）在液氮中研磨组织或细胞，加入TRIZOL试剂，加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。含有的少量DNA可使用无RNA酶的DNaseI处理去除痕量的DNA.,3、mRNA的纯化,真核生物mRNA的3端有一个poly(A)尾，可用亲和层析的方法纯化。(oligo(dT)-纤维素)作用：构建真核生物的cDNA文库。,4、RNA的检测,核酸蛋白检测仪来分析紫外光260nm时的OD値来判断：RNA的浓度：OD260=1 RNA浓度为40g/mlRNA的纯度：OD260/OD280=1.82.0 为最好；当比值小于1.8时，说明有蛋白质杂质；当比值大于2.0时，所提RNA部分降解。,5、RNA的电泳检测,通过琼脂糖电泳进行RNA分析是在变性的条件下进行的。原因：RNA呈单链状态，易形成链内二级结构。常用的变性剂：甲醛,复习内容（P100107）本章所讲的知识点在随后的实验课中均会涉及，希望同学们课后认真复习！1、试验中所使用各种试剂的作用 2、从核酸中如何去除蛋白质杂质（苯酚、氯仿）3、浓缩DNA的方法（无水乙醇、异丙醇等）4、琼脂糖凝胶电泳 5、RNA的提取应注意的事项,预习内容（p1537）1、限制性内切酶 2、DNA聚合酶 3、连接酶 4、碱性磷酸酶 5、T4多核苷酸激酶,
