基因探针-分子杂交技术.ppt

基因探针 分子杂交技术,基因探针,基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。,分子杂交技术的分类,根据其检测对象不同，可分为,基本操作程序,Southern杂交,检测样品DNA的处理,电泳分离及变性处理,转移并固定到滤膜上,探针的制备及杂交,检测与分析,检测样品DNA的处理,提取检测样品的基因组DNA用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段,电泳分离及变性处理,琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,变性处理通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性在0.4M NaOH碱性条件下变性,凝胶,0.4M NaOH,转移并固定到滤膜上,通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上。,转移的方法,毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法,探针的制备,一、探针的合成PCR、化学合成等方法二、探针的标记同位素：3H、35S、32P等非同位素：地高辛、生物素、荧光素等,地高辛：可以与dCTP连接成地高辛-dCTP,原理：地高辛+抗地高辛抗体（带有荧光素或酶的标记）,杂交,预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。,安装杂交管,杂交炉,检测与分析,1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。,Northern杂交,1、检测对象为RNA。2、与Southern杂交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。,Western杂交,1、基本原理和基本过程与Southern 杂交基本相同2、检测对象为蛋白质（或酶）3、SDS-PAGE电泳分离4、用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。,Thank You!,