基因工程载体-噬菌体载体.ppt

2012.09,第二节 噬菌体载体,2,噬菌体载体（phage vectors）,一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体,一、噬菌体载体,噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）,（一）噬菌体的一般特性,结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。,T4 Bacteriophage,7,1.噬菌体的生物学特性,溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。,噬菌体,温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期,烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期,分为两种：,（1）溶菌周期：,噬菌体的生活周期,烈性噬菌体（virulent phage),（2）溶原周期：,感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化,温和噬菌体（temperate phage),2、噬菌体的结构和其核酸类型：结构：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。,3、-DNA的物理图谱,-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT,CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。,噬菌体,组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（lytic pathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(lysogenic pathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,噬菌体,A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR,重组区,cos位点,cos 位点,A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置换型,A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌,生长非必须区段,cI基因：溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging)(after infection)GGGCGGGCGACCTCG-35-CG+GC-53-GCCCCGCCGCTGGA,The phage cos ends,Circular form,Linear form,（二）噬菌体载体的主要类型（1）插入式载体 一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。（2）替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。（3）凯伦噬菌体载体,（2）替换型载体（取代型载体）,外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(20 kb)高感染效率(109 转化株/ug 载体 DNA,比质粒高100-倍),e.g.EMBL3,DASH,替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体是使用最广泛的载体。,（3）凯伦噬菌体载体既有插入型；又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力：几个kb到23kb,（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）,（三）体外包装 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%105%。,噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。,筛选标记：蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 菌体 分子量大小的75%至105%之间。,用途：,b.用于构建基因组或cDNA文库。,c.用于抗体库或随机肽库的构建。,a.用作一般的克隆载体。,（四）-DNA的抽提,大肠杆菌培养至对数生长期2)加入-噬菌体或重组-噬菌体悬浮液，37培养1hr3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12hr4)高速离心，沉淀噬菌体5)苯酚抽提，释放-DNA6)乙醇或异丙醇沉淀DNA,（五）-DNA作为载体的优点,体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli2)装载外源能力为25kb，大于质粒3)筛选方便4)重组-DNA分子提取容易,二、单链噬菌体载体,（一）单链噬菌体载体,M13、f1、fd 噬菌体,单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：,M13 噬菌体,单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。优越性：1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA；2.不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3.单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制 问题；4.容易测定外源DNA片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链DNA分子。,3.M13噬菌体,噬菌体正链,复制,复制型DNA,经pII蛋白造缺口,3,5,经pII蛋白剪切,释出单链DNA(正链),进入下一循环,5,3,3,5,滚环复制,在细菌内的复制模式图,M13噬菌体几个重要特点：,1.M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降 低宿主细胞的生长速度。,2.M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。,3.克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。,M13噬菌体载体 M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（replication form DNA,RF DNA）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。,M13单链DNA噬菌体的生命周期,RF DNA,Phage M13 replication in the host cell:,Nicked by gene 2 protein,+,ss-Rolling circle replication,then cut and ligate,Coated with gene 5 protein,Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect.Linear M13 phagereleased from the cell.,（二）M13载体的构建,（1）克隆区域的选定,基因间隔区（intergenic region,IG区）,J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列)。利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,(2)加入酶切位点,在IG区内加入单一内切酶位点,第一个M13载体：M13mp1：,M13 RF,BsuI不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）,E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）,连接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑,（三）M13系列载体的优点,1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段,2）Xgal显色反应，可供直接选择,3）无包装限制，克隆能力大,4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链,子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。,（四）M13噬菌体用途：,1）DNA序列测定；,2）制备单链DNA探针；,3）用于定点突变的研究。,M13载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。,M13克隆载体分子结构图,三、噬菌粒载体,噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。,噬菌粒载体（phagemid vectors）,由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。,MCS,噬菌体ori,质粒ori,Ampr,lacZ,lacI,约3000bp（比M13小）,克隆能力大,能插入10kb的外源DNA。,两种复制形式,分子量小,1、噬菌粒载体的特点,既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。,既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。,常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；,9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体基本结构：1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。,T7,T3,用于体外转录,3 PCR产物克隆载体 T 载体,pCR系列载体,Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。,结构,pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。,MCS的中部已经切开，各有一个3端突出的T。,特点,PCR产物往往在3端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。,T vector的克隆过程简便！,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,四、柯斯质粒载体,柯斯质粒(cosmid),一种人工构建的克隆载体，包含了噬菌体的cos基因。柯斯质粒能被包装到噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大,（一）粘粒(cosmid),组成：,2.抗性基因；,1.质粒复制的起始位点(ORI)；,3.用于插入目的基因的单个酶切位点；,4.噬菌体的cos位点。,可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。,与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：（1）具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；（2）有像质粒一样的选择标记；（3）cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在1545 kb之间。由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而噬菌体载体多用于cDNA文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一（4)多种单一酶切位点，便于克隆,1、粘粒载体的优点,柯斯质粒载体的特点具有噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,特点：,可插入长达2741kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。,加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体 的功能，而表现质粒的特性。,柯斯质粒载体cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,C)Packaging and infect,Formation of a cosmid clone,Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers,resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,OVer!,