基因工程育种硕士课程.ppt
发酵工程硕士研究生课程,基因工程育种Genetic Engineering Breeding,郭丽琼二0一0年九月二十四日,目标微生物,自然选择,人工诱变,代谢调控育种,基因工程育种,杂交育种,基因工程育种：通过基因工程的手段把外源基因导入宿主菌细胞，有目的地改造宿主菌的遗传性状的一种育种手段。主要包括以下环节：（1）克隆目的基因；（2）获得高效表达元件（如强启动子等）；（3）构建高效表达载体（包括转化子筛选标记）；（4）建立高效转化体系；（5）目的基因的转化和预期工程菌株的获得；（6）转基因生物的安全性评价。,一、基因工程在微生物育种中的作用二、基因工程载体三、遗传转化方法四、基因定位诱变六、基因工程育种实例,内容：,基因工程在微生物育种的作用（一）药物的生产：1.治疗用药物：人干扰素，人胰岛素，人白细胞介素，人生长素，动物生长素，松弛素，抑长素，红细胞生成素，肿瘤坏死因子，表皮生长因子，集落刺激因子，血小板生长因子，凝血因子，超氧化物岐化酶，尿激酶，葡激酶等。2.疫苗：甲肝疫苗，乙肝疫苗，丙肝疫苗，疟疾疫苗，伤寒及霍乱疫苗，出血热疫苗等。,3.单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶，T-细胞及其亚群，狂犬病毒，风疹病毒，沙眼衣原体，T4,IgE,HCG-,抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等单克隆抗体及诊断试剂。,深圳市赛百诺基因技术有限公司的工作人员在基因制品生产线上进行操作。这是亚洲惟一的GMP标准的基因治疗产品生产线。,重组人p53腺病毒注射液又叫“今又生”是肿瘤基因治疗药物，由正常人肿瘤抑制基因p53 和改构的5型腺病毒基因重组而成。前者是今又生发挥肿瘤治疗作用的主体结构，后者主要起载体作用，携带治疗基因p53进入靶细胞内发挥作用。,（二）提高菌种的生产能力,1.提高氨基酸产量：增加基因的拷贝数2.提高酶的产量：改造酶基因3.提高抗生素的产量：抗生素是次级代谢产物，通过改变生物合成途径中关键酶基因来提高其产量。,（三）改进传统发酵工艺 好氧微生物在发酵过程中需要耗掉大量的氧气，若氧气不足产量下降。在生产菌株中转化进血红蛋白基因，可提高生产菌对氧气的耐受能力。,举例：谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 发酵生产谷氨酸和谷氨酰胺；透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb）增强细胞摄入氧的能力；结果表明：在溶氧只有5的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了1.2倍,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了6.5倍,单位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了1.4倍。（北京理工大学）,（四）提高菌种抗性如（1）酵母只能在低温进行保存和运输，改变基因使得酵母能在干燥条件下常温保存和运输。（2）不耐低温的草菇，转进抗冻蛋白基因使其耐寒。,（五）环境处理：构建超级菌株 降解质粒：（1）石油降解质粒；（2）农药降解质粒；（3）工业污染降解质粒，如降解氯联苯、尼龙低聚体、洗涤剂等；（4）抗金属离子质粒，如汞、砷、镍、钴、镉、铜等,二.目的基因的分离 根据特异蛋白质分离目的基因 根据特异mRNA分离目的基因 利用DNA插入分离目的基因（插入诱变法）利用基因定位分离目的基因（图位克隆法）利用表达序列标签分离目的基因 利用同源序列分离目的基因（同源克隆法）,根据特异mRNA分离目的基因（1）差别杂交（differential hybridization）,又称：差别筛选（differential screening）（2）缩减杂交（subtractive hybridization），又称：缩减cDNA克隆（subtractive cDNA cloning）（3）mRNA差别显示（mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction,DDRT-PCR）,（4）抑制性消减杂交（suppressive subtractive hybridization，SSH）（5）代表性差异分析（representational difference analysis，RDA）（6）cDNA扩增片段长度多态（cDNA-amplified fragment length polymorphisms，cDNA-AFLP）,实验原理：,材料准备,举例：（1）草菇冷诱导基因表达差异片断（2）耐药性微生物的基因表达差异（3）不同培养基下漆酶基因表达差异,技术路线,一号样（最优）,RNA提取,二号样（碳源）,三号样（Cu2+）,cDNA双链合成及纯化,TaqI 酶切,TaqI 接头连接,漆酶酶活测定,酶活变化最大时,差异片断的分离、回收、纯化,选择性扩增PCR,预扩增PCR,片断连接转化、测序,差异显示,测序结果的BLAST比对和序列分析,PCR条件优化,总RNA的提取及反转录,反转录主要依赖于试剂盒完成,接头的设计,原则：（1）选择限制性酶：如Eco R I（5-GAATTC-3)（2）PCR引物设计原则,引物的设计,（1）预扩增引物设计（2）选择性扩增引物设计,预扩增结果,选择性扩增的优化结果,选择性扩增的优化结果,片断的回收和测序,ZL41：CCCGATCTCGTGCTGTACGGCGTTCCGTGTGACGCGATCCCGACAATCGCCTTCAACTGGGGCGGCGCCAACTGGACGATCAGTGCGGACAACTTTAATATCGGCCAGGAGGGCAACAGGTGCATCGGCGCCATCTCCGGTCGCGACGTTGGACTCGGTGATAACTCTTGGCTTGTGGGCGATAGGTAAGTCTATCTTCCACGTTGATAATCAATTGTATCGCTGGCTCATGATGAGACGCGTAGCTTCTTGACGGGGGTGTACTCGGCCTTCTCATACGACGACCGGGCCGTGGGCTTCGCCGCTTTGGCTTGATTTTTTTCCCTACACATTTTTGTTTGTTGTGGACGTTGTCCGTCCGAACGCGGTGCTCATGTTGAACATGGGCACGATTGCGCCACGTTGGTTCACCTTACGTATCCTAAGAAACCTGCTTAGCTAGTATGACACTTCTCCAACATATCATTAGATGCTTGCGGGGTACTCTTGTTCCTTATAGAATCTAAATTCAGAATGATCAGCCCCGGATTCTCAATTTCGGGCACCTTGCGCAATGATTGAATGACGAAATAGGGCCACACACAGGTTAAGTATGGCTGTTCTTATCGCGGTGTCGTGTCGCGAATGATGAACAGCGTTGGTCCCTGTTTGACTGCTTGCGTGTACAGTTATGATAATACTCAGAAATGTAGCTCAGAACATGGTGACGAATAAACGAAACCCAGCAAGTGCTTATTTACGCCGCGTCACAGCAATTTCAAAATAATATATACCTTTCTTAGCTCTA,片断的分析,三.基因工程载体,(一）质粒载体的组成,克隆质粒载体：含抗性基因、自主复制序列（ori）常用克隆质粒载体（1）pUC系列（含ampr、lacZ、Mutiple cloning site）（2）pBR322(含ampr、tetr、Mutiple cloning site)（3）Bluescript M13系列（含ampr、lacZ、Mutiple cloning site）（4）噬菌体载体,表达质粒载体:组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。,限制性内切酶及其酶切位点,种类：I类、II类、III类。I类和III类限制性内切酶兼有修饰（甲基化）作用以及依赖于ATP的切割活性。主要存在于生物DNA损伤修复以及抵制入侵DNA。基因操作常用的限制性内切酶是II类。II类限制性内切酶特点：（1）识别4-6bp的特异核苷酸序列；（2）产生特异的末端：粘性末端、平端如:,Eco RI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5,Pst I,5-C T G C A G-33-G A C G T C-5,Hae III,5-G G C C-33-C C G G-5,表达载体构建,启动子选择,（1）原核生物常用启动子：70启动子（2）植物常用启动子：35S启动子（3）食用菌常用启动子：,食用菌常用启动子：1）ras（）启动子；2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)启动子；3）spr1(serine proteinase gene)启动子；4）trp1（tryptophan synthetase gene）启动子；5）其他：cel1(cellulose-growth-specific gene)启动子、cel3 启动子、cel4启动子、pri(primase gene)启动子、gla1(glu-coamylase gene)启动子等。,筛选标记（1）营养缺陷型标记：营养缺陷互补标记基因有:A)ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化;B)pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞、蘑菇遗传转化;D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。,（2）抗生素抗性筛选标记：抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨苄青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博来霉素抗性基因（Ble+）。在培养基中添加抗生素进行筛选。,（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记：A)如Bialaphos 抗性基因;B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;,（4）代谢产物抗性筛选标记 如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不敏感，而对5-FL十分敏感，当把trp3iar 转入草菇和平菇时，这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的。,载体构建策略（）选择合适的表达载体:含启动子、筛选标记、终 止子（）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点,举例说明食用菌启动子功能检测载体构建过程,四遗传转化方法原核生物遗传转化热激法电击法真菌遗传转化,(一）PEG法 PEG(polyethylene glycol)法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇、鬼伞等,（二）电激法 电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，Royer JC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化，获得转化子。,（三）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法（Microprojectile bombardment）,自Klein TM等1987年首次利用钨粒对洋葱的组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植物的遗传转化。主要原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。,（四）限制性酶介导的DNA整合法 这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，其英文为Restriction Enzyme-Mediated DNA Integration，简称REMI。它是由Schiestl RH 等于1991年第一次在酿酒酵母菌（S.cerevisiae）上创立使用29，1992年Kuspa A等在网柄菌（Dictyostelium discoideum）上发展了该法。此法应用于旋孢菌（Cochliobolus heterosporus）、白色念球菌（Candida albicans）和食用菌上的鬼伞（Coprinus cinereus）、香菇（L.edodes）等的遗传转化均能有效地提高转化率。,主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体DNA，产生的染色体DNA末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNA相连接。该法亦可作为REMI标签对功能基因进行分离。,（五）农杆菌介导法 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，它侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤，在冠瘿瘤的形成中，农杆菌只留在植物细胞间隙中，其环状质粒Ti上的T-DNA在细菌内被加工、剪切、复制后转入植物细胞并随机插入到植物的基因组中。农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然有效的遗传工程系统，已广泛应用于双子叶植物和单子叶植物的遗传转化研究上。,应用：1998年de Groot MJA等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化，他以真菌的分生孢子和菌丝为受体成功地把T-DNA转入曲霉（A.awamori）、木霉（Trichoderma harzianum）、链孢霉（Neurospora crassa）、双孢蘑菇（A.bisporus）、草菇中。,五.基因定位诱变,定位诱变方法删除法：在目的基因中删除一个或若干个碱基序列，使基因发生重排而造成其性状的改变。如啤酒酵母的蛋白酶A基因。插入法：在目的基因中插入单个或多个核苷酸序列，使原基因发生改变进而改变基因产物。取代法：将目的DNA的某个碱基进行置换，使置换处编码的氨基酸发生改变。特定的G:C变A:T 错配取代,将变异基因送回染色体 1）体内自发的同源重组；2）定位整合作用,六.基因工程育种实例,耐寒冻转基因草菇的培育,草菇的特点：1.草菇是典型的高温型食用菌，不耐低温,菌丝在4低 温下2d即自溶而死亡；,2.子实体在4低温下24h后即液化、腐烂；,3.采收后的子实体容易开伞，营养价值下降，口感差，商业价值低,4.草菇生物转化率低：20-30%,5.常规的杂交育种培育抗寒的草菇菌株十分困难,抗冷冻蛋白基因,mfc基因的克隆,实验方案,表达载体pvg-afp,表达载体pgVvs-mfc,PEG介导共转化,草菇菌丝原生质体,PCR与Southern杂交鉴定,含有mfc基因的转基因草菇,转基因草菇后代遗传稳定性分析,拟转化子的筛选,草菇对0低温致死时间的确定,多功能纤维素酶酶活测定,表达载体（pgVvs-mfc）的构建,目的条带,图2 PCR鉴定,图3 酶切鉴定,ACCCGCCAAAAAGCACAGAGGGCATGCGCTTGACTGAAGCGTCGACGAATCACTAGTGATTTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAGTCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTATCTATTTTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATCCATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGGCTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGGCCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCCTTTCAAAGGCACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGGCGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTCGGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAAGGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAGATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTCCGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCCATTGACTGCTTGAATAATCGAATTCCCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA图4 表达载体pgVvs-mfc 测序结果图,表达载体pvg-afp,草菇原生质体的制备与再生,图5 草菇V23原生质体含D-甘露醇的PDA培养基上再生,草菇原生质体再生菌丝0低温致死时间的确定,表1 草菇菌丝0致死时间的测定,注：RG为33培养能恢复生长；D为33培养不能恢复生长,0低温筛选获得草菇拟转化子,图6 拟转化子0低温处理后恢复生长情况,草菇拟转化子的PCR检测,图7 草菇拟转化子基因组DNA的PCR扩增结果(图未全附）,阳性质粒,V23-CK,水对照,草菇拟转化子的Southern杂交鉴定,基因组DNA的提取,图8 草菇转化子基因组DNA凝胶电泳结果,基因组DNA的酶切,图9 草菇转化子基因组DNA的酶切结果,Southern杂交分析,图10 转化子基因组DNA的Southern 杂交结果M为DNA Marker-Hind；ck-为转化的草菇；ck+为质粒pgVvs-mfc；（a）1-7分别为TVM23-8、TVM23-1、TVM23-10、TVM23-11、TVM23-12、TVM23-13、TVM23-14；（b）1-7分别为TVM23-2、TVM23-3、TVM23-4、TVM23-5、TVM23-6、TVM23-7、TVM23-9。,（a）,（b）,转基因草菇的多功能纤维素酶酶活,图11 CMC酶活最大值及其显著性分析,以CMC为诱导底物,图12 FPA酶活最大值及其显著性分析,以稻草为诱导底物,图13 CMC酶活最大值及其显著性分析,图14 FPA酶活最大值及其显著性分析,转基因草菇的栽培及其生物学特性,试管中菌丝生长,图15 草菇菌丝在试管中的生长情况,转基因草菇的子实体发育,（a）,（b）,（c）,（d）,图17（a）为TVM23-3；（b）为TVM23-9；（c）为TVM23-14；（d）为对照,表5 转基因草菇的增产量,转基因草菇的孢子收集,草菇开伞,图19 孢子收集装置,图18 草菇正常开伞,表6 单孢分离的草菇担孢子在PDA平板上最佳浓度的测定,12个/L,转基因草菇的单孢分离及其后代遗传稳定性分析结果,图20 单孢萌发的单菌落图,单孢分离,F1 代转基因草菇的PCR鉴定,图21 F1代转基因草菇DNA提取,图22 F1代转基因草菇PCR鉴定,C,D,高转化率转基因草菇,左：转基因草菇；右：对照,转基因草菇的安全性评价,Thank you!,
