基因工程研究策略和实践.ppt

基因工程研究策略和实践,基因决定性状,青霉素能产生青霉菌家蚕能吐出蚕丝为人类利用,定向改造基因的设想,1.能否让细菌“吐出”蚕丝？2.能否让微生物产生人胰岛素、干扰素等昂贵药物？,经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物DNA的技术-基因工程,基因工程的概念,将获取的目的基因片段在体外与载体DNA通过人工剪切、连接构成DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因、改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程。,基因工程过程示意图,从细胞中分离出DNA,基因工程的研究策略,一、目的基因的分离(donor DNA)二、载体DNA及其改造(Vector DNA)三、体外DNA重组(DNA recombination)四、重组DNA的转化(Transformation)五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增(identification&clone amplification)六、目的DNA在受体细胞中的表达(gene expression),一、目的基因的分离,从cDNA文库中分离目的基因从基因组DNA文库中分离目的基因PCR扩增目的基因片段化学方法人工合成基因,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,逆转录酶,载体,受体菌,复制,1.从cDNA文库中分离目的基因,cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,2.从基因组DNA文库获取目的基因,包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况,3、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法,PCR扩增仪,4.化学合成法获取较短的目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,二、载体DNA,载体(Vector)载体是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。,常用载体 质粒 病毒载体 噬菌体 粘性质粒/粘粒,载体的选择标准,有复制起点，能自主复制；具有筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定；具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；分子量小，以容纳较大的外源DNA。表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的分类-按作用分,穿梭载体(shuttIe vector)又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体。其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效 率。如pKSV一10、pJDB219载体等。,载体的分类-按来源分,质粒(plasmid vector)病毒(virus vector)噬菌体(phage vector)粘性质粒/粘粒(cosmid vector),1.质粒载体:(1)分子量较小，在细菌中有较多的拷贝数。(2)松驰型。(3)具有一个以上的标志，便于筛选。(4)具有数个或一个单一的酶切点。天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，,常用的质粒载体,pBR322,pUC118/119,2病毒载体（1）整合型载体：外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。（2）游离型载体：能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如：腺病毒。,3.噬菌体载体 现用的噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，只能插入较小的外源DNA片段(10kb)。如gt10、gt11；替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的DNA区段可被外源插入的DNA片段取代，能插入较大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。,4.Cosmid质粒 由DNA cos区与质粒重组建造而成。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。分子量小（约46kb），可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库。如 cosmid pHC79,三、体外DNA重组,概念：不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组体DNA分子的过程。分类：粘末端连接平齐末端连接法同聚物核苷酸末端法人工接头连接T-A克隆,限制性内切酶“分子剪刀”,型限制性内切酶，能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列并将DNA切断的内切酶。识别序列的特点；(I)专一；(2)常由46个碱基组成；(3)具有回文序列经切割可以生成平头末端或粘性末端。可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。,DNA连接酶“分子针线”,连接双链DNA分子中相邻3-OH和5-磷酸基之间的磷酸二酯键的形成。最常用的是T4连接酶，可以连接粘性末端和平头末端。,1.粘末端连接（a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5端P基团，使5端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。（b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆),Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2.平齐末端连接优点：可连接任何一对DNA 可恢复一个酶切位点或产生一个新酶 切位点缺点：连接率低要求连接酶及底物浓度高,GAA,GAA,3.同聚物核苷酸末端法 在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。应用末端转移酶在DNA片段3末端制备粘末端。避免自身环化 互补序列较长时（4bp)，不需连接酶,4.T-A克隆,T-vector两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中增加延伸时间，Taq酶可在产物的3端多加一个A,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),四、重组DNA的转化,1.基本概念转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。感染（infection）：病毒或重组病毒DNA进入细胞的过程。转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。,2.受体细胞感受态感受态(competent)：细胞最易摄取和“容忍”外来DNA的生理状态。致敏：诱导细胞进入感受态的操作。,转化动物细胞常用的方法 1.磷酸钙共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；3.脂质体转染法；4.电穿孔法；5.病毒转染法；6.显微注射法。,五、重组体筛选、鉴定与克隆扩增,平板筛选插入失活插入表达电泳筛选PCR筛选核酸杂交DNA测序免疫学检测法,1.常用筛选/鉴定阳性重组体的方法,初步筛选,精确鉴定,表型鉴定,1.平板筛选法（1）插入失活（insertional inactivation)：在载体某个基因序列的限制性内切酶位点上插入外源DNA后，使该基因失去活性，从而不能表达其相应的功能。常以此现象作为标记，筛选被这种重组体转化的细胞。,(插入失活法)抗药性标记选择,1.Amps Tets（转化失败）2.Ampr Tetr（转化成功，但仅转入载体，无重组）3.Ampr Tets（转化、重组均成功）,（2）插入表达（insertional expression)载体设计时，在筛选标志基因前连接一段负调控序列（抑制作用），当目的基因在此插入时，使其对下游的抑制作用丧失，从而下游的筛选标志得到表达。,CI为负控制序列（抑制Ter表达）当DNA插入使CI失活 Ter表达，由此作为阳性克隆的筛选。,2.酶切-电泳法筛选 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后再抽提出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，电泳后根据DNA分子大小不同，鉴别真正重组体DNA，排除假阳性和载体自我连接载体双重体。该法不能鉴别插入片段大小相似的非目的基因片段的假阳性。,联合酶切鉴定同源末端连接重组子中 DNA插入片段的方向,3.PCR法筛选 提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测有无相应电泳带。,4.核酸分子杂交（hybridization）两条不同来源的含有互补核苷酸序列的单链核酸分子，通过碱基配对规律形成一个新的稳定的双链核酸分子的过程 菌落原位杂交（Hybridization in Situ）（以细菌为受体细胞）使用与目的DNA互补的探针鉴别阳性转化菌,菌落原位杂交法筛选,复印至硝酸纤维素膜上,用NaOH菌体裂解DNA变性,杂交,放射自显影,32P-cDNA,与放射性cDNA杂交的菌落的斑点,细菌菌落,单链DNA结合到膜上,5.DNA测序,测序：确定DNA链上确切的碱基顺序方法：对初步筛选的阳性重组子，扩增后抽提质粒，酶切回收片断，进行DNA测序确认。,6.免疫学检测法鉴定表达产物 依据抗原、抗体特异性结合反应的原理，以单克隆抗体对表达产物进行特异性检测。,六、目的DNA在受体细胞中的表达,基因工程表达系统,大肠杆菌系统枯草杆菌系统,酵母细胞系统昆虫细胞系统哺乳动物细胞系统,原核表达系统,真核表达系统,基因工程操作的主要步骤,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,基因工程的实践,1.利用重组酵母生产乙肝疫苗,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能生长，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但其大规模生产受到病毒表面抗原来源的限制，而且提取物需要高度纯化，纯化过程中往往会发生失活现象。此外，最终产品还必须严格检验其中是否混有病人的致病病毒。所有这些工序导致制造成本高居不下，因此这种传统的乙肝疫苗生产方法不能满足几亿接种人群的需求。,图10-12,宿主采用组氨醇脱氢酶缺陷型(HIS4)的 P.pastoris，经双交换整合重组后，染色体上的aoxl丢失，而整合入aoxl启动子HBsAg-aoxl终止子及加 poly(A)信号序列、his4和3aox1。整合后的细胞可在不含His的培养基上生长,在酵母细胞中，这种蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人体细胞中那样，组装成多亚基 的复合物，能诱导产生抗体。这个质粒结构十分稳定，在含甲醇的培养基中培养 200h后仍不会发生改变。将重组菌置于240L发酵罐中，其表达量相当于约9l06剂疫苗。,基因工程的实践,2.弥漫性掌跖角化病患者KRT9突变对中间丝网状结构的影响为了研究其中3个突变（N160S、L167S、A176P）对中间丝网状结构的影响，就要构建N160S、A176P、L167S的表达载体，观察它们在细胞内的定位和动态变化。,从皮肤cDNA文库和患者基因组DNA 中扩增出KRT9的野生型和突变型，将其克隆至pEGFP-N1质粒中，分别转染了Hela细胞和Hacat细胞。,