基因工程的载体和受体.ppt

第三章 基因工程的载体和受体（ChapterIII Vectors and Hosts for Gene Cloning）,1,一、用于基因克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,2,携带外源DNA进入宿主细胞的工具能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞,1.载体的概念,（一）载体的功能及特征,3,2.载体的功能（function of vector）,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,4,3.载体应具备的条件（characteristics of vector）,可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或整合位点 具有较高的外源DNA的装载能力多克隆位点（multiple cloning site,MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点 具有合适的筛选标记（selection marker）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中,5,质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体,4.载体的种类,6,（二）质粒（plasmid）,1.质粒,质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。,质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。,7,（1）质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒：1-3 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒：10-60 拷贝 relaxed plasmid,但细胞生长环境中，存在蛋白质合成抑制剂（氯霉素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，但质粒仍可扩增，使其数量可达数千拷贝。,2.质粒的基本特征,8,（2）质粒的不相容性（incompatibility）,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群。,9,质粒不相容的分子机制,两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。,两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。,10,（3）质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F质粒。,如Col、R质粒的一些成员。,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定。,11,（4）携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,12,3.几种代表性质粒,F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,Figure.Representative FERTILITY PLASMID.A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,13,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒拷贝数及复制，抗性决定因子大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。R-因子在细胞内的拷贝数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,R因子（resistence factor）,14,编码大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌，由Col因子编码。Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1：分子量约为5106Dalton，无接合作用，多拷贝；ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80106Dalton，与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个拷贝。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,Col因子（colicinogenic factor）,15,只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,降解性质粒,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,巨大质粒（mega质粒）,16,即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,Ti质粒（tumor inducing plasmid）,17,4.质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101：8.8 kb、拷贝数 5、四环素抗性标记基因 Tetr,ColE1：6.5 kb、拷贝数 20-30、大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124：ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr,18,删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量。灭活某些质粒的编码基因。加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列-多克隆接头(Polylinker)。加入特殊的基因表达调控元件。,（1）质粒改造策略,19,（2）一个合格质粒的组成要素,复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Amp、Kan。多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段。P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子。T（Terminator）：终止信号。poly(A)加尾信号：稳定mRNA。,20,5.质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,21,报告基因：载体上导入，证明载体已经转入宿主细胞中，将含有目的基因的宿主从其它细胞中区分出来，比如抗药性报告基因、LacZ、luciferase、GFP等,22,6.如何阅读质粒图谱,质粒的装载量小于10 kb,23,RBS：ribosome-binding site 原核RBS：SD sequence真核RBS：Kozak sequence,24,7.重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,（1）pBR322,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,25,（2）pUC18/19,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ（E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O）,26,pUC18/19的正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,27,蓝白斑筛选：pUC18/19质粒上的LacZ基因包括：一段-半乳糖苷酶的启动子、编码肽链的区段、一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用，使X-gal生成蓝色物质，这种现象即-互补。用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了LacZ的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。,28,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,29,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,30,（3）pGEM-3Z,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子，用于外源基因的高效表达,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,31,8.质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度低、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,32,（1）氯化铯密度梯度离心法,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,ocDNA：开环DNAL-DNA：线状DNA,33,（2）碱裂解溶法,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,34,溶液I：调节pH，悬浮菌体，抑制DNase的活性溶液II：裂解细胞膜（主要是NaOH），临用前配制，SDS是为沉淀染色体DNA作准备溶液III：中和NaOH，促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA详见http:/,35,36,37,（3）沸水浴法,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,38,（三）噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工,程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,39,1.大肠杆菌的噬菌体DNA,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,40,(1)噬菌体的生物学特性,l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,lDNA全长48502个核苷酸,lDNA上至少有61个基因,生物结构,41,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,42,感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,43,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,44,溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两个基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,45,噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（42）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。clts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts1857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。,46,ori,目的基因,PL,阻遏蛋白,30下培养：,47,目的基因,阻遏蛋白,42下培养：,失活,48,（2）DNA载体的构建,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此需要缩短野生型l-DNA的长度，才能提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,缩短长度,49,插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,50,取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,51,删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除多余的酶切位点，每种限制酶只保留1-2个位点。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添限制酶位点。,52,加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容。l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,53,Imm434标记,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑。,54,lacZ标记,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶的片段，与b-半乳糖苷酶的片段互补，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。,55,X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,是-半乳糖苷酶的显色底物,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，半乳糖的类似物，是乳糖操纵子的诱导物。,构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因序列中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,56,（3）-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、lgt11,取代型载体,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正选择型载体,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），,这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外,源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌,体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。,57,（4）DNA重组分子的体外包装,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,58,（5）DNA及其重组分子的分离纯化,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放DNA,乙醇或异丙醇沉淀DNA,59,（6）DNA作为载体的优点,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,60,2.大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,（1）M13噬菌体的生物学特性,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,生物结构,61,（2）M13 DNA载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,复制DNA(replication form DNA，RF DNA),62,（3）M13 DNA载体的特点,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用。,M13重组分子筛选简便：被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb。,63,与动植物受体细胞相适应的载体，一般选择相应动植物的病毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,3.病毒DNA载体,64,（四）考斯质粒(cosmid)与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和,1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序,列和质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时,又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这,便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒,和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内,不能形成噬菌体颗粒。,65,1.考斯质粒（cosmid）,（1）考斯质粒载体的构建,考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为30-45 kb,pHC79,66,（2）考斯质粒载体的特点,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,67,2.噬菌粒（phagemid or phasmid）,（1）噬菌粒载体的特点,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列载体要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,68,（2）重要的噬菌粒载体,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-IG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体：为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白，使其能够合成单链DNA。,pUC118/119,lacI：编码乳糖操纵子的阻遏蛋白,69,乳糖操纵子：大肠杆菌中控制半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。在没有诱导物时，调节基因lacI 编码阻遏蛋白，与操纵基因O 结合后抑制结构基因转录；乳糖的存在可与lac阻遏蛋白结合诱导结构基因转录，以代谢乳糖。,70,pBluescript：体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录。,提取出来的单链DNA重组分子，在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录。,f1-ori：线状噬菌体复制起始区,71,（五）人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,72,1.细菌人造染色体Bacterial Artificial Chromosome，BAC,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的BAC在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝,BAC主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,73,2.酵母人造染色体Yeast Artificial Chromosome(YAC),（1）酵母人造染色体的构建,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,YAC载体应含有下列元件：,两个来自嗜热四膜虫的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；,酵母染色体的着丝粒序列(centromere4,CEN4)；,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-400 kb,URA3:乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶,TRP1:色氨酸合成基因,酵母染色体的复制子(autonomously replicatingsequence，ARS),74,克隆位点：EcoRI。该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码产物抑制赭色表型(成为白色)。如果用不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。,75,（2）酵母人造染色体的使用,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,在利用pYAC4载体克隆时，要将pYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。,76,77,二、用于基因转移的受体菌或细胞,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,78,作为基因工程的受体细胞，应利于外源DNA的转化或转导，同时又要有较好的安全性。野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞，因其自身具有限制和修饰系统，对未经甲基化处理的外源DNA分子有一定的降解作用，导致外源DNA的转化或转导效率低下。此外，野生型大肠杆菌对其他生物种群可能存在潜在的致病性。因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。,79,（一）受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-，recB-，recC-）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外。,80,限制与修饰系统。限制与修饰系统是维持野生型细菌种属特异性的保护系统，其限制与修饰作用分别由限制性核酸内切酶和修饰甲基化酶来完成。当外源DNA分子进入细菌细胞内部时，限制系统产生限制作用，将来自不同生物的外源DNA分子或重组DNA分子降解破坏。而对于自身DNA分子则由修饰系统加以甲基化修饰，免于限制系统的限制作用。这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源DNA分子的转化或转导效率。大肠杆菌的限制系统主要由hsdR基因编码，因此具有hsdR-遗传表型的大肠杆菌菌株均丧失了降解外源DNA的能力，大大增加了外源DNA的可转化性，转化效率可提高1000倍左右。如进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便于重组DNA分子的多种基因操作。,81,重组系统。在野生型细菌中，进入细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生体内同源重组反应，该重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。其中RecA是一个单链蛋白，在同源重组过程中起着不可替代的作用，它能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至10-6。同样,recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。,不过，由于rec-菌株的生理条件较难控制，以rec-菌株作为受体菌时转化或转导效率往往比rec+受体菌细胞低得多，所以有时人们先以rec+受体菌起始转化，筛选到正确的转化子后，再转移至rec-受体菌中保存。,82,易于转化或转导可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。如大肠杆菌膜蛋白Lama等就是噬菌体的特异性吸附受体。另外，还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌，这样做能大大提高外源DNA分子的转化效率。,83,有明显的选择性差异遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有氨苄青霉素抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后，载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征，可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。,84,感染寄生缺陷型相当多的细菌对其他生物（尤其是人和牲畜）具有感染和寄生效应，重组DNA分子导入这些细菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体内并广泛传播，如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一场灾难。因此从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。,85,86,（二）各种基因工程受体的特性,1.大肠杆菌（Escherichia coli）,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。,产结构复杂、种类繁多的内毒素。,87,2.枯草杆菌（Bacillus subtilis）,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素。,适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。,遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。,88,3.链霉菌（streptomycete）,抗生素的主要生产者，分子遗传操作相对简便，不产内毒素。,主要用于抗生素生产菌株的改良。,遗传不稳定，生长相对缓慢。,89,4.酵母菌（yeast）,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定。,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核型受体菌。,内源性蛋白产物种类繁多且含量高。,90,5.昆虫细胞（家蚕）Insect cell（silkworm）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定。,适用于真核生物基因的高效表达。,DNA重组操作系统欠完善。,91,6.哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统。,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。,细胞培养条件苛刻，生长缓慢。,92,7.植物细胞（拟南芥、烟草）,作为农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用。,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产、农作物品质的改良。,遗传操作繁琐。,93,（三）实验室常用的基因工程受体,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Amps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母,酿酒酵母,94,实验技术,核酸序列分析（DNAMAN）,95,