基因工程的基本操作程序讲稿.ppt

一、基因工程的概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,1.限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么?,限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,DNA连接酶的作用是连接被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一 原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,一 原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,启动子,终止子,真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomic library),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,每个受体菌DNA分子都包含一段不同的外源DNA片段,1）反转录法：,聚焦二：目的基因的获取方法,cDNA(互补DNA),蛋白质,mRNA,DNA,DNA,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?,利用PCR技术扩增目的基因,问题:为什么要扩增目的基因?,原理:碱基互补配对原料:4种脱氧核苷酸条件:(1)引物:人工合成的一段核苷酸系列(2)酶:DNA聚合酶特点:快速(指数形式扩增),过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,高温变性,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,(二)利用PCR技术扩增目的基因,第二课时,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,(二)基因表达载体的构建,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么,质粒的构建与改造1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2)灭活某些质粒的编码基因。3)加入易于识别的选择标记基因。4)加入特殊的基因表达调控元件。,一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。,(三)将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理及适用范围,(三)将目的基因导入受体细胞,适用于单子叶植物,基因枪法,（3）花粉管通道法,将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,(三)将目的基因导入受体细胞,3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,问题探讨：,将人体的基因转入大肠杆菌中，都能产生相应的基因产物吗？（例如要能否通过大肠杆菌生产人们所需要的糖蛋白是否可行？）,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,