基因工程常用的克隆载体.ppt

,第三章 基因工程常用的克隆载体,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,第一节 质粒载体,一、质粒的定义,存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主复制的遗传成分（复制子）,复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位,染色体DNA质粒DNA噬菌体DNA,质粒DNA编码的表型,抗性特性,抗生素抗性：重金属抗性：毒性阴离子：其他：,AmprCmlrKanrStrrTetr,Hg、Ni、Co、Pd、Zn,砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐,嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体,代谢特性：,修饰寄主生活方式：,植物冠瘿病、发根病,冠瘿碱代谢,二、质粒DNA分子的特性,结构特性,SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA，covalently closed circular DNA）OC型 开环DNA（ocDNA，open circular DNA）L 型 线性DNA（L-DNA，line DNA）,染料结合特性：呈平面结构的染料（EB）可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比L-DNA少，因此密度较大。,提取纯化质粒DNA：,氯化铯-溴乙锭密度梯度离心法（CsCl-EtBr）,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、存在溴乙锭污染！,变性特性 cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条件即可复性。,提取纯化质粒DNA：,微量碱变性法,裂解菌体细胞,加NaAc调pH至4.8,质粒DNA纯度较低、周期较短！,复制特性,拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分子的数目,严紧型复制：1-2个松弛型复制：10-100个,制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制剂，增加质粒拷贝数！,三、质粒载体应具备的条件,具有复制起始位点具有至少两种易被检测的选择性标记具有多克隆位点（MCS）,多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一识别序列所组成的DNA序列,具有尽可能小的相对分子质量,易于分离纯化目的DNA装载能力强拷贝数高多重酶识别位点几率低,应属于松弛型复制应为非传递型,四、几种常用的质粒载体,pBR322来源：大肠杆菌Ori：标记基因：apr、tcr分子大小：4363bp拷贝数：50-100/cell,pUC18来源：大肠杆菌Ori：标记基因：apr、lacZMCS：分子大小：2686bp拷贝数：1000-2000/cell,第二节 噬菌体载体,噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增DNA缺失达总量20%的DNA时，仍不影响其特性，可为外源基因提供装载空间,一、基本概念,噬菌体感染周期：,E.coli,溶源途径,二、噬菌体的形态结构及繁殖特性,形态结构,繁殖特性,噬菌体,E.coli,溶源菌,裂解,侵染,浑浊噬菌斑,三、DNA的结构及功能,左臂区：AJ中间区：J N右臂区：N R,c基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活c基因表达：溶源途径 c基因不表达：溶菌途径,四、噬菌体载体的构建,消除多余的限制性内切酶位点点突变基因组置换、缺失增加单一酶切位点去除非必要区段噬菌体头部蛋白可包装DNA大小：75105%DNA长度（3852kb）增加筛选标记基因,五、噬菌体载体的主要类型,插入型载体：DNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源DNA插入的酶切位点特点：承载能力较小（10kb）筛选标记：基因插入失活免疫功能失活的插入型载体-半乳糖苷酶基因失活的插入型载体,免疫功能失活的插入型载体,体外包装,不表达阻遏蛋白,-半乳糖苷酶失活的插入型载体,无色混浊噬菌斑,不表达酶,替换型载体：又称取代型载体。在DNA可替换片断两端具有两个限制酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNA片断取代特点：承载能力大筛选标记：DNA大小-半乳糖苷酶基因替换,六、l-DNA作为载体的优点,DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组DNA分子的筛选较为方便,Thank You!,