基因工程复习.ppt

一基因工程的诞生（）,一基因工程的理论基础1基因拼接的理论基础:不同生物DNA的化学组成和结构相同(1)DNA是生物的主要遗传物质；(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋。2外源基因在受体内表达的理论基础:所有生物共用一套遗传密码子(1)基因是控制生物性状的基本单位，具有独立性；(2)遗传信息的传递都遵循中心法则所阐述的信息流动方向；(3)生物界共用一套密码子。,1（原创题）下列关于基因和基因工程的叙述，有几项是不正确的（）（1）1944年，艾弗里等人证明了肺炎双球菌的遗传物质是DNA，并证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一个生物个体。（2）1953年，梅塞尔松和和斯塔尔建立了DNA双螺旋结构模型。（3）20世纪70年代，人们认识到自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码。（4）1967年，科学家发现细菌拟核之外的质粒有自我复制能力并可以在细菌间转移。（5）科学家发现的工具酶有限制酶，DNA连接酶和运载体。（6）1972年，柏格首先构建了一个体外重组DNA分子。A0项B1项C2项D3项,补充1以下有关基因工程的叙述，正确的是（）A基因工程是细胞水平上的生物工程 B基因工程的产物对人类都是有益的C基因工程产生的变异属于人工诱变 D基因工程育种的优点之一是目的性强补充21976年人类首次获得转基因动物，即将人的生长抑制素因子的基因转入大肠杆菌并获得表达。这里的表达是指该基因在大肠杆菌内（）A能进行DNA复制B能进行转录和翻译C能合成生长抑制素因子 D能合成人的生长激素,二基因工程的原理及技术（）,二DNA重组技术的基本工具1限制性内切酶(1)来源：主要从原核生物中分离。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)切割后的末端有黏性末端和平末端两种。,2DNA连接酶(1)功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。(2)分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。(3)作用位点：两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。,比较与DNA有关的酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基。（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋（PCR技术）。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）限制性内切酶：（5）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。,补充：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,(1)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的脱氧核苷酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此，DNA连接酶不需要模板。,补充：限制酶和DNA连接酶的区别与联系,3基因进入受体细胞的载体(1)载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。(2)条件：能在宿主细胞中保存下来并大量复制；有一个至多个限制酶切割点以供外源DNA插入；有特殊的遗传标记基因，便于筛选。补充：载体的特点及作用(1)一般来说，天然载体往往不能同时具备载体必须具备的条件，所以在基因工程中需要根据不同的需要，对载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。,(2)作为载体必须具有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制性内切酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。,(3)大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。它存在于细菌的细胞质中，上面一般含几个到几百个基因，控制着细菌的抗药性、固氮、抗生素合成等性状。由于土壤农杆菌很容易感染植物细胞，使细胞生有瘤状物。所以科学家培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做载体。(4)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。,三基因工程的基本操作程序1目的基因的获取2基因表达载体的构建（基因工程的核心）3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测和鉴定,1目的基因的获取：从基因文库中获取；利用PCR技术扩增目的基因；人工合成，常用的方法是反转录法和化学合成法。补充：原核细胞、真核细胞基因结构的比较,补充：PCR技术请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。,第1组：；第2组：。,2基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。,(2)组成：目的基因；启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA；终止子：位于基因的尾端，使转录停止；标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因。补充：终止子位于基因的末端，使转录停止。终止密码位于mRNA上，使翻译终止。,3将目的基因导入受体细胞,4目的基因的检测和鉴定,三基因工程的应用（）,补充：动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。基因治疗目前只是处于初期的临床试验阶段，在临床上未开展、未实现这方面的治疗。DNA分子制作探针进行检测时应检测单链，即将双链DNA分子打开。Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程生产的。,四蛋白质工程（）,蛋白质工程与基因工程比较,1下列对基因工程的理解，正确的是()可按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程对基因进行人为删减或增添某些碱基是体外进行的人为的基因重组在实验室内，利用相关的酶和原料合成DNA主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术在DNA分子水平上进行操作一旦成功，便可遗传ABC D,C,解析：一旦成功，便可遗传因为基因工程一般是将外源基因与载体连接导入受体细胞中，载体有自我复制功能，或者能将目的基因整合到细胞自身的DNA上，这样细胞进行分裂的时候目的基因也会随质粒复制或者是细胞染色体DNA复制而复制，是可遗传。,判断正误质粒通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构 若要获得真核生物的目的基因，则一般采用人工合成方法为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的的基因,错误,正确,错误,错误,用基因工程的方法培育的抗虫植物也能抗病毒基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育体型巨大、品种优良的动物 基因工程在医药方面，可用于基因诊断和治疗疾病 基因工程在环境保护方面可用于环境监测和对污染环境的净化,错误,错误,正确,正确,将ada（酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD.每个人的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子,C,解析：C错误：基因工程通常不选择天然质粒直接作为目的基因的载体，而选择以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用质粒作为目的基因的载体。这种实用质粒不是单纯为某一目的基因构建的，而需要有较广泛的使用功能，也就是说要能够和多种目的基因形成重组质粒。由于不同的目的基因两端的碱基序列存在差异，因此提取不同的目的基因选择的限制性核酸内切酶也不同，所以这种实用质粒就需要有多种限制性核酸内切酶的单一切割位点。,如质粒pET28b具有BamH、Bgl、Hind等16种限制性核酸内切酶的单一切割位点，若用BamH处理质粒pET28b，在其产生的切口中插入ada形成重组质粒，该重组质粒的另外15个限制性核酸内切酶识别位点都没有插入ada。故C选项的含义错误。,解析：认为B选项表述的含义是错误的原因分析：目的基因和质粒能够形成重组质粒的关键是目的基因和质粒被限制性核酸内切酶切割后具有相同的粘性末端。形成相同的粘性末端可以采用两种方法：用相同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒；用同尾酶切割目的基因和质粒。若选择同尾酶分别切割目的基因和质粒，再由DNA连接酶作用形成重组质粒。该重组质粒可能无法被同尾酶中的任何一种限制性核酸内切酶识别和切割。,如限制酶Bgl的识别序列为AGATCT（表示切割位点，下同），限制酶BamH的识别序列为 GGATCC。若用Bgl切割目的基因（见图1），用BamH切割质粒（见图2），可获得具有相同粘性末端序列（GATC）的DNA片段。再用DNA连接酶处理形成重组质粒（见图3），其“接点”的碱基序列为5 AGATCC 3，既不能被Bgl识别，也不能被BamH识别，故认为重组质粒可能不存在限制性核酸内切酶的识别位点。,实际上基因工程技术的操作过程中会遇到很多问题，如重组质粒导入受体细胞后，目的基因的表达可能会出现目的基因不表达、表达水平过低或过高、表达产物的氨基酸序列差错等多种表达异常情况。当出现目的基因的表达异常时，需要回收目的基因，并对目的基因进行加工修饰，最终使目的基因表达出人们所预期的效果。因此在构建重组质粒时，要求连接形成的“接点”序列，必须能被特定的限制性核酸内切酶识别、切割，以便回收插入质粒的目的基因。,以图3所示的重组质粒为例，它还可以被识别序列为GATC的限制性核酸内切酶切割回收。如使用Mbo或Sau3A（两者的识别序列都为GATC）处理该重组质粒时，在两个“接点”位置将重组质粒重新切割开，形成两个片段，即目的基因和质粒（见图4）。,认为D选项表述的含义是错误的原因分析：重组质粒随机导入大肠杆菌细胞内，可能存在多个重组质粒同时导入同一个大肠杆菌细胞内的情况。此时只要其中一个重组质粒上的ada表达，其它重组质粒上的ada不表达，该大肠杆菌也能够合成腺苷酸脱氨酶。故认为插入质粒的ada不一定都表达了腺苷酸脱氨酶分子。,基因工程技术操作过程，需要对转化条件的控制，使每个受体细胞只进入一个重组DNA分子。也就是说试题中提到的大肠杆菌细胞内只含有一个重组质粒，因此只要该大肠杆菌有腺苷酸脱氨酶的产生，就说明插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。故D选项的含义正确。,课外复习：金版教程P3例1，P6例2，P9例2.,单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。,（1）从图中可见，该基因突变是由于_引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切点，突变基因上只有2个酶切点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 _条，突变基因显示_条。（2）DNA或RNA分子探针要用_等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列（-ACGTGTT-），写出作为探针的核糖核苷酸序列_。,（3）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠有胎儿-1中基因型BB个体是_，Bb的个体是_，bb的个体是_。,金版教程P3例1基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是-GGATCC-，限制酶II的识别序列和切点是-GATC-。根据图示判断下列操作正确的是()A目的基因和质粒均用限制酶切割B目的基因和质粒均用限制酶切割C质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割,D,金版教程P6例2图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行。,（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是，其合成的产物是。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是。,金版教程P9例2下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越。,（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna 切割，原因是。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。,下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达 A将目的基因直接打上放射性标记，导入受体细胞后用检测仪跟踪 B在含某种抗生素的培养基中培养导入了重组质粒的大肠杆菌 C利用相应的DNA探针与受体细胞DNA分子进行杂交 D提取受体细胞蛋白质，利用抗原一抗体特异性反应进行检测,A,解析：成功导入（转化）之后还要能够保持在子代细胞中稳定存在才可以，有些质粒虽然初次可以导入，但是可能不能在宿主细胞中稳定存在和大量复制，宿主细胞多次分裂之后就丢失了。即使可以稳定存在，而多次繁殖以后，子代细胞也无法跟踪检测，因为新合成的子代目的基因的DNA分子不具有放射性，也就无法跟踪判断了。另一种角度：B也不能检测表达。B选项也是经不起推敲的，受体细胞如果是真核细胞呢？,基因工程中大题内含子和外显子什么是基因治疗蛋白质工程的原理精子和卵子的形成过程有什么区别核移植过程为什么选用MII期的卵母细胞,