基因工程原理第四章.ppt
第四章 载体,载体(Vector),为什么要有载体？外源DNA转入宿主细胞后常常不能稳定复制载体是什么？可以在宿主细胞内稳定复制的DNA载体实现稳定复制的方式 1）作为独立的复制子进行复制 质粒、噬菌体 2）可以重组到宿主染色体DNA进行复制 真核载体：酵母、病毒,第一节 大肠杆菌质粒载体,质粒,原核生物染色体外的稳定复制体,因此可利用作为克隆载体。有时，也泛指所有的环状载体DNA。质粒在琼脂糖电泳时，常呈三条带，迁移快慢从快到慢依次是：超螺旋、线性、开环。,质粒的分类,按是否携带促进细菌接合的转移基因(tra基因)，分为接合型和非接合型按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型(多拷贝)和严紧型(低拷贝)一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数多,质粒的复制起始决定质粒的拷贝数,质粒具有两种调控起始的主要机制1)通过反义RNA调控 现在大部分质粒载体(ori来自ColE1质粒)的拷贝数调控方式2)通过关键蛋白调控,质粒克隆载体的理想特性,相对分子量小(易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点)可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性(便于筛选)存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上(便于克隆、筛选）,pUC8载体,衍生自pBR322含有复制起始位点(ori)和另两个基因：氨苄青霉素抗性基因和lacZ基因,Lac筛选(蓝白斑筛选),蓝白斑筛选：pUC质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。,pUC8等大肠杆菌质粒的缺点,不能操作大于10kb的DNA片段大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组DNA分子在宿主细胞中丢失,第二节 噬菌体基因组载体,噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期,为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。,噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期,噬菌体随意DNA(optional DNA),噬菌体基因组大小为48.5kb，其中有15kb只在噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体过程(即溶源性感染周期)中必须，该片段的删除不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的噬菌体颗粒合成，称为随意DNA。,噬菌体载体,插入型载体(insertion vector)，部分或全部随意DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。替代型载体(replacement vector)，随意DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的DNA在连入时替代随意DNA。,cos位点与体外包装,cos位点，噬菌体是一个线性分子，其两端具有12个核苷酸、序列互补的单链突出。cos位点处可发生连接形成串联体，当所插入片段大小合适时（连接产物大小在37-52kb间)，就会通过体外包装混合物而包装到衣壳内部。否则，就会被体外包装混合物切下，不被包装。,第三节 其它载体,其它载体,用于连入更长DNA片段用于特殊用途：1)得到单链DNA 2)RNA表达载体 3)蛋白表达载体,用于连入更长DNA片段的载体,基因组绘图与测序需要把更长(18kb)的片段连入载体柯斯质粒(cosmid)Fosmids噬菌体P1载体系统(bacteriophage P1 vector)BAC(bacterial artificial chromosome)PAC(P1-derived artificial chromosome)YAC(Yeast artificial chromosome)Mega-YAC,用于连入更长DNA片段的载体,Cosmid与Fosmids,Cosmid 1)具有cos位点的质粒，质粒大小5-8kb 2)具有和噬菌体一样的感染性 3)进入细胞后不能指导合成新的噬菌体颗粒，而是如质粒一样复制，因此重组DNA可以从克隆而不是噬菌斑中得到Fosmids 包含了F质粒的复制起始位点和载体cos位点。与Cosmid相似，但拷贝数较低,酵母人工染色体(YAC),在酵母中繁殖，是以染色体为根据。真核染色体的三个重要组件 1)着丝粒 2)端粒 3)一个或多个复制起始点,YAC载体工作原理,YAC的优点与缺点,优点：天然酵母染色体大小为230-1700kb,因此能插入上至Mb的片段缺点：插入不稳定，克隆的DNA会存在重排现象，形成新的序列组合。,BAC,BAC是基于大肠杆菌F质粒构建的。细菌F质粒是一种较大的质粒，具有插入较大片段的能力，可以克隆300kb及更长的片段，且插入片段很稳定。,噬菌体P1载体系统与PAC,噬菌体P1载体系统与载体类似，但是基因组更大，具有插入更大片段的能力，可以克隆125kb的片段。PAC综合了P1载体系统和BAC的特点，具有克隆长达300kb片段的容量。,用于特殊用途的载体,用于特殊用途：1)得到单链DNA 2)得到RNA探针和双链RNA 3)蛋白质表达载体 a)最大量合成蛋白 b)简化蛋白纯化 c)促进蛋白溶解 d)促进蛋白外运,用于得到单链DNA的载体,DNA测序、S1核酸酶作图、寡核苷酸诱变等分子生物学操作需要得到单链DNAM13载体,表达载体,用于表达RNA和大量蛋白的载体载体启动子经过优化，有利于大肠杆菌RNA聚合酶的结合分为RNA表达载体和蛋白表达载体,用于得到RNA探针的表达载体,用噬菌体启动子 1)活性强 2)大肠杆菌启动子不识别 3)噬菌体所编码RNA聚合酶，如SP6,T7和T3,是单独多肽链，比大肠杆菌的酶更易于操作,用于得到双链RNA的载体,具有方向不同的双启动子载体LITMUS载体：具有相反方向的T7启动子，通过限制酶线性化的差异实现不同链的转录,LITMUS载体工作原理,影响克隆基因蛋白表达的因素,启动子的强度转录终止质粒拷贝数质粒稳定性宿主细胞生理状况翻译起始序列密码子选择mRNA结构,用于最大量合成蛋白的载体,含有可控制的启动子：1)PL 2)T7 3)trc(tac)4)BAD通过诱导实现最大量的表达,trc与tac：lac与trp启动子的杂合，可受乳糖与IPTG调控,pET载体：T7启动子,PL启动子调控：cl和trp调控,pBAD载体：BAD启动子,简化蛋白纯化的载体：标签蛋白的引入,谷胱甘肽-S-转移酶(GST)谷胱甘肽琼脂糖麦芽糖结合蛋白(MalE)直链淀粉树脂多组氨酸(His-tag)镍柱生物素 亲和素/链酶抗生物素,简化蛋白纯化的载体：亲和纯化,促进蛋白溶解和外运的载体：避免包含体的形成,包含体：过量表达的不可溶蛋白硫氧还蛋白融合蛋白的引入分泌信号蛋白的引入现代表达载体实际上多种特性的整合物,
