基因工程制药新版.ppt

第三节 基因工程制药生产的基本过程,五、宿主细胞的选择和基因导入操作,体外重组的DNA分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质。随着时间的推移而逐渐失活。（一）宿主细胞的选择（二）具体的转移技术（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（四）酵母菌中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达,（一）宿主细胞的选择,1、宿主细胞应满足的条件2、宿主细胞的类型,1、宿主细胞应满足的条件,（1）容易获得较高浓度的细胞。（2）能够利用廉价原料进行生产。（3）不致病。（4）不产生内毒素。（5）发热量低。（6）需氧低。（7）具有一定的细胞形态。（8）需有适当的发酵浓度。（9）容易进行代谢调控。（10）容易进行DNA重组技术操作。（11）产物的产量稳定、产率高。（12）产物容易提取和纯化。,2、宿主细胞的类型,原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细 胞和植物细胞。（1）大肠杆菌（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌（4）酵母菌（5）丝状真菌（6）动物细胞,（1）大肠杆菌,优点：（1）生长迅速、大规模发酵经济。（2）分子遗传结构清楚、操作简单。（3）基因工程研究中采用最多的表达体系。,缺点：（1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。（2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来，形成杂质。给提取带来困难。（3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。（4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白产物进行糖基化及磷酸化等修饰。（5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。（6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。,至2004年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基因重组生物技术药物18种：重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。,（2）枯草芽孢杆菌,优点：（1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中。（2）不会形成包含体。缺点：（1）不能使蛋白质产物糖基化。（2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌系统，常常对蛋白质产物造成破坏。,（3）链霉菌,优点：（1）不致病，（2）使用安全，（3）分泌能力强，（4）可将培养产物直接分泌到培养液中，（5）具有糖基化能力 近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人们的重视。,（4）酵母菌,酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中进行克隆和表达。优点：（1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物，（2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行大规模培养，（3）无毒性，（4）基因工程操作简单，（5）表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外，（6）能够对蛋白质产物进行糖基化，（7）真核基因在酵母中表达良好。,至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重组生物技术药物8种：胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵母表达系统表达。,（5）丝状真菌,曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了成熟的发酵和后处理工艺。优点：（1）有很强的蛋白质分泌能力，（2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、肽剪切。,（6）动物细胞,优点：（1）表达产物可以分泌到培养液中，（2）培养液成份完全由人所控制，（3）所分泌的基因产物接近于天然产物，（4）产物容易得到提纯。缺点：（1）生产慢、（2）生产率低、（3）培养条件苛刻、费用高，（4）培养液浓度较稀。,至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达的基因重组生物技术药物53种，其中激素类5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种，治疗性抗体17种。,主要基因工程表达体系比较,（二）具体的转移技术,1、转化作用2、转导作用,1、转化作用,（1）基本概念（2）转化作用的特性（3）感受态细胞（4）人工感受态细胞（5）转化程序（6）影响转化的因素,（1）基本概念,转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入原核细胞的过程.,（2）转化作用的特性,（1）是自然界经常发生的现象之一。（2）转化作用的前提条件是宿主细胞必须转变为感受态细胞。（3）转化作用的先决条件是要获得携带目的基因的重组DNA分子。,（3）感受态细胞,感受态(competent):指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的改变。,（4）人工感受态细胞,在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。所有生物细胞均可处理成人工感受态细胞。制备人工感受态细胞的方法：（1）将对数生长期细胞于低温、低渗的CaCl2溶液中处理，就可成为感受态细胞。（2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳离子DETE-Sephadex处理，改变细胞膜结构，也能成为感受态细胞。,5转化程序,大肠杆菌E.coli培养至对数生长期取20ml，悬浮于0.1M CaCl2离心，收集沉淀的原生质球。再悬浮于0.1M CaCl2 加入2-3ug重组的DNA，混匀 0放置30min42，90s冰浴5min离心，收集沉淀的细胞将细胞涂于选择性培养基上，进行培养根据菌落特性，筛选出基因工程菌,（6）影响转化的因素,重组DNA转化率很低，在0.1%左右。影响因素：（1）宿主的限制酶对外源性重组DNA的限制作用，会大大降低转化率，（2）宿主细胞的人工感受态形成率，会影响转化率，（3）重组DNA的构型与转化率有一定的关系，环状DNA的转化率要比线性DNA高出10-100倍，（4）外源基因与宿主DNA和同源性越高，其转化率也越高。（5）重组DNA的浓度越高、其转化率也越高，DNA的纯度越高、其转化率也越高。,转化过程总结示意图,2、转导作用,（1）基本概念（2）转导条件（3）转导程序（4）转导作用分类,（1）基本概念,自然界中，通过噬菌体或者病毒的感染作用，将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程，称为转导（transduction）。感受态细胞吸收以噬菌体、病毒为载体的重组DNA的过程称为转染(transfection)。也属于转导作用。自然界许多温和噬菌体都具有转导功能。,（2）转导条件,体外重组的DNA，要通过转导途径进入宿主细胞，必须经过蛋白质包装的环节，DNA+噬菌体头部蛋白+噬菌体尾部蛋白形成完整的噬菌体颗粒，才具有感染能力。,（3）转导程序,A、蛋白质体外包装程序B、转导程序,A、蛋白质体外包装程序,蛋白质的体外包装是通过互补作用实现的。噬菌体的D基因、E基因是表达蛋白质的主要基因。（1）D基因所表达的蛋白质占20%、D基因突变，在宿主体内产生大量头部蛋白。（2）E基因所表达的蛋白质占78%、E基因突变，在宿主体内产生大量头尾蛋白。,B、转导程序,用于制备包装蛋白质的宿主细胞-cI857大肠杆菌E.coli、BHB2690、BHB2688。D基因突变型宿主BHB2690培养、并且进行溶菌处理，提取DNA-d+外源性目的基因DNA+E基因突变型宿主BHB2688培养、并且进行溶菌处理，提取DNA-e 温育,包装成完整的外源基因-噬菌体重组颗粒。（具有再感染能力）去感染大肠杆菌E.coli完成转导,（4）转导作用分类,（1）限制性转导作用-由温和的噬菌体或者病毒DNA为载体所构成的重组DNA，经过体外包装，形成完整的噬菌体或者病毒颗粒，所进行的转导作用称为限制性转导。（2）广义性转导作用-任意DNA片段，或者重组的DNA，经过体外包装成噬菌体颗粒，所进行的转导作用称为广义性转导。,3、脂质体介导的融合作用,（1）定义（2）脂质体的特性（3）脂质体介导融合的步骤（4）脂质体介导的应用,（1）定义,将重组的DNA分子包埋于脂质体微囊之中，通过脂质体微囊与宿主细胞的融合作用，而将外源性目的基因转移到宿主细胞内的过程称为脂质体介导的融合作用。,（2）脂质体的特性,脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状 结构。原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体 颗粒带正电荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及单链RNA等导入细胞内 主要适用于真核细胞,可对基因进行瞬时表达和稳定表达。,（3）脂质体介导融合的步骤,分为2步：（A）人工脂质体的制备（B）脂质体与宿主细胞的融合,（A）人工脂质体的制备,在含有重组DNA分子的水溶液中+磷脂+吐温80（乳化剂）通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。,（B）脂质体与宿主细胞的融合,将脂质体微囊与宿主细胞混合，在PEG、或者在其它促融剂的作用下，经过一定条件就会产生融合作用，最终将重组DNA导入到宿主细胞之中。,（4）脂质体介导的应用,对于一些微生物如放线菌细胞，由于无法形成感受态，也就不能通过转化作用导入外源性DNA。但是，通过脂质体介导方法，就能实现脂质体与放线菌细胞之间的融合，来获得基因工程放线菌。,脂质体2000:Invitrogen,规格0.75ml/1.5ml报价1700元/2900元,4、显微镜注射技术,在特定的显微镜下，用特制的玻璃微管，将重组的DNA直接注射到宿主细胞内的方法。显微镜注射技术是一种直接、简单、而又准确、可靠的DNA机械转移技术。主要用于真核生物,是一种全新的基因导入技术，它把DNA包被在金或钨的微粒中，然后由基因枪将此包被颗粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目前国际上最先进的基因导入技术。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。,5、基因枪注射技术,基因枪注射技术,利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，几乎所有细胞都可用此技术，此方法转染的DNA不仅是线性的，还可是环状的。条件：电压：300600V 维持时间：20100ms 温度：0,6、电穿孔技术,7、磷酸钙DNA共沉淀法基因转移技术,此法受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%5%的外源DNA可进入受体细胞核中，约有1%DNA可在细胞中稳定表达。,8、病毒介导的生物学方法,带有外源基因的逆转录病毒或DNA病毒在包装细胞内可形成完整的病毒颗粒，并被释放到培养基中，感染哺乳动物细胞，能有效实现基因转移。,（三）大肠杆菌中的基因导入和表达,1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体2、真核基因导入大肠杆菌的具体方式3、影响真核基因导入大肠杆菌的因素,1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体,（1）pBV220（2）pET,pBV220,侯云德 分子病毒学家 中国工程院院士1.分离了我国副流感病毒、型 2.研制出包括1b、2a、2b、等亚型的基因工程干扰素系列产品3.成功组建原核高效表达载体pBV220系列及pBV320系列通用型高效表达载体,（1）pBV220,已经成功用于表达IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多种细胞因子。A、结构 B、优点,A、结构,pBV220共3665bp。共由6个部份组成：（1）pUC8的MCS（2）核糖体rrnB终止信号（3）pBR322的第4252-3735位（4）pUC-18的第2066-680位（5）噬菌体cIts抑制基因+PR启动子（6）pRC-23的PL启动子+SD序列。,质粒pBV220的结构框,ori-复制起始点clts857-抑制子基因，在31时，其基因产物具有阻抑PL活性，当温度升高时，这种阻抑活性就丧失，PL开始指导合成mRNA。PR-启动子1PL-启动子2BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、HindIII、PstI-限制酶切位点形成多克隆区域，在此插入外源性目的基因。RrnB-核糖体终止基因（终止子）PvuI-青霉素抗性基因Ampr。,B、优点,（1）可转化任何菌株（2）能防止出现“通读”现象（3）质粒分子量很小，有利于增加其拷贝数量（4）能插入大片段的外源基因,（2）pET,pET被认为是最有潜力的系统。来源于T7 噬菌体。A、克隆宿主可用大肠杆菌K12的HB101、JM103等细胞。pET克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的细胞损伤。B、表达受宿主细胞的T7 RNA聚合酶控制。表达宿主为BL21、DE30。表达菌在LB培养基、或在M9培养基中生长良好。C、表达产物可以用金属络合物的方式进行分离，能够达到高纯度、高收率。,MCS,pET32 a(+)以T7lac作为启动子；pET32 a(+)还带有T7.Tag和His-Tag融合标签，此类标签可用于检测和纯化相关目的蛋白；pET32a(+)上与目的基因共表达的硫氧还蛋白可以促进二硫键形成，增加目的蛋白可溶性，便于分离纯化。,2、真核基因导入大肠杆菌具体方式,共有3种方式（1）融合蛋白（2）非融合蛋白（3）分泌型表达蛋白,（1）融合蛋白,A、定义B、优缺点C、改进措施D、融合蛋白的具体表达方式,A、定义,是指产生的蛋白质同时含有细菌蛋白+目的蛋白。融合蛋白的氨基酸端由大肠杆菌原核基因编码、而羧基端则由真核基因编码。最终表达出来的蛋白质=1条原核多肽+1条真核多肽，称为融合蛋白。,B、优缺点,优点：（1）蛋白质在细菌体内比较稳定，不易被细菌的酶类所降解，（2）容易实现高效表达，（3）基因操作简便。缺点：由于蛋白质中含有细菌蛋白，会影响真核蛋白的免疫原性，只能用作抗原,不能作为人体注射用药。,C、改进措施,（1）在细菌蛋白和目的蛋白间加入Ile-Glu-Gly-Arg，可被人体内的凝血因子Xa识别而切开。在体外，采用特异的蛋白酶（凝血因子X、胶原酶、肠激肽酶）对融合蛋白进行降解。（2）在细菌蛋白和目的蛋白间加入Met，CNBr可专一性识别Met并切开，形成原核多肽+真核蛋白质分子，从而获得具有生物活性的天然真核蛋白质分子。,D、融合蛋白的具体表达方式,融合基因-融合蛋白 基因结构为“原核启动子原核SD序列原核结构基因片段真核结构基因序列原核终止密码子”（D1）融合表达载体的构建（D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达的蛋白质）（D3）融合蛋白的切除方法,关键：融合蛋白与外源蛋白的阅读框要对齐两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融合蛋白的操作。,（D1）融合表达载体的构建,（D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）,（D3）受体蛋白的切除方法,化学断裂法：溴化氰（CNBr）-Met-（切点）-AA酶促断裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序列:IleGluGlyArg-（切点）-AA,（2）非融合蛋白,A、定义B、优缺点C、具体表达方式,A、定义,非融合蛋白表达方式是指工程菌大肠杆菌进行蛋白质翻译时，是以真核生物的mRNA的AUG为翻译起始点，最后表达出的蛋白质中不含细菌蛋白。非融合蛋白表达方式也称为包涵体型外源蛋白的表达。,B、优缺点,优点-非融合蛋白能够较好地保持真核蛋白质的生物活性。缺点：（1）容易被细菌体内的蛋白酶所破坏，（2）非融合蛋白的氨基端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时常常引起人体的免疫反应。,C、非融合蛋白的具体表达方式,非融合蛋白表达方式可分为2种：（C1）非融合基因非融合蛋白（C2）融合基因非融合蛋白,（C1）非融合基因非融合蛋白,基因结构为“原核启动子原核SD序列ATG真核结构基因序列原核终止密码子”要求1：SD序列和ATG之间的距离要合适，相差2-3个碱基，其表达效率就大受影响。要求2：ATG和真核结构基因序列之间必须加接人工接头，以保证ATG之后的真核基因不发生通读框架的改变。,（C2）融合基因非融合蛋白,基因结构为“原核启动子原核SD序列原核ATGTGATG（真核基因起始结构）真核结构基因序列原核终止密码子”这一方式能够提高表达效率。,（3）分泌型表达蛋白,A、定义B、分泌蛋白表达的原理图示C、常用的大肠杆菌信号肽D、优缺点,A、定义,分泌型表达蛋白是利用大肠杆菌的信号肽基因来构建分泌型表达系统，将外源基因接在信号肽基因后，当表达的目的蛋白跟随着信号肽来到细胞周质，被细胞周质中的信号肽酶识别而切除,从而释放有生物活性的蛋白质。基因结构为“原核启动子原核SD序列原核结构基因片段细菌信号肽基因真核结构基因序列原核终止密码子”。,B、分泌蛋白表达的原理图示,C、常用的大肠杆菌信号肽,碱性磷酸酶信号肽（phoA）膜外周质蛋白质信号肽（OmpA）霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）,D、优缺点,优点：（1）表达时没有活性的蛋白质，通过信号肽切割，能产生有生物活性的蛋白质，（2）分泌的蛋白质产物由于经过切割，不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸，不会引起人体的免疫反应。缺点：（1）产量不高，（2）信号肽不进行切割或不能定点切割。,3、影响真核基因在大肠杆菌表达的因素,（1）外源基因的拷贝数量（2）影响转录水平的因素 在目的基因上游，必须安装一个适当的启动子。常见的启动子有lac、trp、tac、bla等。,（3）影响翻译水平的因素核糖体结合位点的有效性直接影响基因产物的表达。SD序列和真核基因起始密码ATG间的间距，会影响基因产物的表达。mRNA的二级结构，特别是5端的二级结构。mRNA的稳定性，通常它的半衰期为几秒-25min.密码子偏爱性是影响翻译效率的重要因素。,(4)影响蛋白质水平的因素 表达产物的稳定性 蛋白酶 降解 表达的蛋白质 蛋白质分子量越小，表达产物越不稳定 解决方案：A构建融合蛋白 B利用信号肽 C位点特异突变(p77为例)D蛋白酶缺陷型大肠杆菌,细胞代谢负荷减轻宿主细胞代谢负荷：A 细胞生长和外源基因表达分开B 细胞生长与重组质粒复制分开,（5）工程菌的培养条件 温度 诱导剂浓度 诱导时间,（四）酵母菌中基因导入和表达,酵母菌的表达系统包括-载体，启动子等控制序列，宿主细胞。1、载体2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素,1、载体,（1）定义（2）类别（3）克隆载体（4）表达载体,（1）定义,酵母载体是可以携带外源性目的基因进入酵母细胞内、并且能在酵母细胞内保存、复制、随着酵母细胞的分裂而传递到子代细胞的DNA或者RNA单位。,（2）类别,（A）YEp-称作酵母附加体质粒，这类载体相对比较稳定，并且具有较高的拷贝数、转化率，因此得到了广泛的应用。（B）YRp-称作酵母复制型质粒，这类载体稳定性差、拷贝数量小。（C）YCp-称作酵母着丝粒质粒，这类载体有很好的稳定性，但是拷贝数只有1个。（D）YIp-称作酵母整合型质粒，这类载体有很好的稳定性，但是拷贝数只有1个。,（3）克隆载体,从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易，因此酵母质粒的加工和制备多数是在大肠杆菌中进行的，只在最后阶段才转入酵母。那些既能够在大肠杆菌中进行质粒复制和表型选择，又能够在酵母菌中进行质粒复制和表型选择的载体，称作克隆载体。在酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori、Ampr、Tetr部分，构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记位点。,（4）表达载体,表达载体=酵母菌启动子+载体+外源性目的DNA+酵母菌终止子。表达载体分为2类：（1）普通表达载体-只要能方便地引入外源基因并表达，对于表达产物的组成、氨基酸序列无特定的严格要求。（2）精确表达载体-此类载体要求外源基因有特定的插入位点，以便基因表达产物与天然产物相同。既无多余的也无缺失的氨基酸。,2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素,（1）外源基因的拷贝数量（2）启动子的类型（3）分泌信号的表达效率（4）终止序列对表达效率也有影响（5）外源蛋白质的糖基化（6）宿主酵母菌株性能,（1）外源基因的拷贝数量,外源基因的拷贝数量及其在宿主细胞内的稳定性对于基因表达起决定作用。,（2）启动子的类型,酵母菌启动子=上游激活序列+近端启动子（内含一个起始密码子和转录所必需的TATA序列）。酵母菌启动子类型分2类：（1）组成型启动子-它在酵母生长的各时期都能发挥作用。具体的启动子基因有PGK、ENOL、GAPDH、CYCl、TRI、MF、ADH1，2。（2）诱导型启动子-启动子基因有PH05、GALI、GAL10，其基因表达受诱导物的影响.,（3）分泌信号的表达效率,分泌信号的表达效率对于目的基因表达有影响。分泌信号=信号肽+前导肽的编码序列 分泌信号帮助目的蛋白质分泌出酵母细胞，而且会对蛋白质进行糖基化加工和修饰。,（4）终止序列对表达效率也有影响,常用终止序列：ADH1CYC1MfalPGK,（5）外源蛋白质的糖基化,应用酵母菌生产外源蛋白质的糖基化能够增强所表达出蛋白质的生理活性。外源蛋白经过酿酒酵母合成、氨基末端修饰、二硫键形成、蛋白质进行折叠和糖基化，可以更有效地以活性形态分泌到培养基中，便于精制和分离。,（6）宿主酵母菌株性能,宿主酵母的生理状况等因素对外源基因的表达有明显的影响。作为表达用的酵母菌株应该具备下列条件：（1）菌体生长能力要强大。（2）菌体内源蛋白酶要弱。（3）菌株的性能要稳定。（4）菌株的分泌能力要强。,（五）动物细胞中基因导入和表达,1、转基因动物的历史2、反转录病毒法构建3、显微注射法构建4、优点5、缺点,1、转基因动物的历史,转基因动物(transgenic animal）:通过基因工程技术将外源DNA导入动物生殖细胞，干细胞，早期胚胎，并在染色体上整合，稳定传给子代的技术，转基因技术诱导基因组改变的动物称转基因动物。,1982，Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠的受精卵中获得巨型小鼠（supermouse），从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高一步，引起生物学界极大的关注，为基因工程育种提供诱人的前景。,外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系,2、反转录病毒法构建,利用反转录病毒可以转移小片段DNA（10kb）,3、显微注射法构建,在光学显微镜下，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。,5、优点,（1）基因的表达产物可以迅速通过细胞分泌到培养液之中，（2）培养液成人完全能够进行人工控制，（3）基因产物在动物细胞内已经进行了糖基化，更加接近于天然产物。,6、缺点,（1）动物细胞生长慢。（2）单位体积的生产率低。（3）培养条件要求苛刻、费用高。（4）由于用于基因表达的细胞均为传代细胞，而一般认为传代细胞都是恶化性细胞，因此，由它所生产出的基因表达产物有可能存在致癌的疑问。,