基因工程一章课件.ppt

专题1 基因工程专题2 细胞工程专题3 胚胎工程专题4 生物技术的安全性和伦理问题专题5 生态工程,选修3 现代生物科技专题,异想天开,基因工程诞生的背景,1、20世纪中叶,基础理论取得了重大突破 DNA是遗传物质的证明 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译2、技术发明使基因工程的实施成为可能 基因转移载体的发现 工具酶的发现 DNA合成和测序技术的发明 DNA体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 第一例转基因动物问世 PCR技术的发明,DNA重组技术的基本工具基因工程的基本操作程序基因工程应用蛋白质工程的崛起,基因工程要点,1.1 DNA重组技术的基本工具,基因工程需要哪些基本工具?,基因工程至少需要3种工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,限制酶分布在哪里？有何特点？断开的是什么化学键？作用结果怎样？,磷酸二酯键,氢键,主要从原核生物中分离纯化出来,1、来源：,2、特点：,3、作用：,4、结果：,具有专一性,识别某种特定的核苷酸序列，使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开,形成两种末端,切开磷酸二酯键,黏性末端,平末端,切割DNA分子时产生的两种不同末端,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1、作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,E.coliDNA连接酶：连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端(效率较低),2、种类：,形成磷酸二酯键,三、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,1、常用的运载体：,质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒等,质粒：主要存在于细菌等微生物体内。独立于拟核或染色 体DNA外的能进行自我复制的小型环状DNA分子,大肠杆菌及质粒载体结构模式图,2、作为运载体所具备的条件：,结构小对细胞无害能自我复制有标记基因：有多个酶切位点等,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等,小结,随堂练习：,1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,答案：C,2.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D,答案：D,3.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是 A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,答案：BD,4、不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,答案：D,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,1、获取目的基因,2、构建基因表达载体,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、提取目的基因,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,原核细胞基因结构,真核细胞基因结构,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成（通过DNA合成仪）,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？如何构建基因文库？如何从基因文库中获取目的基因？,基因文库,基因组文库,部分基因文库（如cDNA文库）,包含了一种生物的全部基因的基因文库叫做基因组文库,包含了一种生物的部分基因的基因文库叫做部分基因文库,基因组文库与部分基因文库的比较,构建基因文库的方法,鸟枪法(直接分离法),反转录法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,鸟枪法(直接分离法),某种生物的mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录,反转录法,如何从基因文库中得到所目的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因的表达产物蛋白质 等特性。,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,随堂练习,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。,PCR技术,原理：前提：条件：方式：结果：,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等,使目的基因的片段在短时间内成快速地扩增,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560引物与模板的单链DNA互补配对结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,（3）人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（通过DNA合成仪）,1、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D,D,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程,质粒,目的基因,限制酶切割,一个切口两个黏性末端,两个切口目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,1.目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D,D,2.基因表达载体的组成,目的基因,启动子,终止子,标记基因,位于基因的首端,RNA聚合酶识别和结合位点，转录起点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞和筛选含目的基因的细胞,它们有什么作用？,编码蛋白质的结构基因,复制原点,复制的起点,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体和目的基因，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必须以表达载体的方式携带进去。,注意,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等,三、将目的基因导入受体细胞,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法（单子叶植物常用）,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，在花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,过程:,含目的基因表达载体,受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌细胞,用Ca2+处理,感受态细胞,重组表达载体DNA溶于缓冲液,感受态细胞吸收表达载体,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C D,B,D,四、目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测RNA分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，先将两种生物的DNA从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分离成为单链。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素标记。如果两种生物DNA单链之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出,从而检出所要查明的DNA或基因,知识延伸抗原抗体杂交,Western杂交蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，提取目的基因在大肠杆菌中表达出的蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质（抗原）注入动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以还要加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,1.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质A B C D,C,2.（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产 人类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR技术人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因 复制原点将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、感受态法目的基因的检测与鉴定检测：是否导入、转录、翻译,1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为基因工程最主要的目的是为了获得目的基因表达产物，目的基因要成功表达，表达载体还需要启动转录的启动子、终止转录的终止子和标记基因等。,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？,原因：农杆菌具有趋化性，双子叶植物的受伤组织会产生一些糖类和乙酰丁香酮、羧基乙酰丁香酮等酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中。而单子叶植物不能产生这些吸引农杆菌的糖类或酚类物质，故不易被农杆菌侵染而将目的基因导入其中。做法：选择合适的农杆菌菌株，给小麦加乙酰丁香酮等酚类诱导物，使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,不可以 因为糖蛋白的蛋白质肽链上有糖链，这些糖链是在内质网和高尔基上加工完成的，大肠杆菌不存在这两种细胞器，所以不能用大肠杆菌来生产这种糖蛋白。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）逆转录出小鼠的编码-珠蛋白的基因（cDNA）。（2）用DNA连接酶将cDNA和大肠杆菌中的质粒连接,并在cDNA前后接上启动子和终止子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个完整的表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,1.3基因工程的应用,1.植物基因工程硕果累累,1）提高农作物的抗逆能力2）改良农作物的品质3）利用植物生产药物等方面,植物基因工程技术主要用于哪些方面?,抗虫转基因植物,1)提高农作物的抗逆能力,转基因抗虫苹果,转基因抗虫水稻,所采用的抗虫基因主要有：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,抗病转基因植物,所采用的抗病基因主要有：抗病毒的病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；抗真菌的几丁质酶基因和抗毒素合成基因,其它抗逆基因主要有调节渗透压的基因（抗盐碱、抗干旱）、抗冻蛋白基因（抗寒）、抗除草剂基因等。,其它抗逆转基因植物,2）利用转基因改良植物的品质,富含赖氨酸的转基因玉米,将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物或改变必需氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高必需氨基酸的含量,将控制果实成熟的基因导入果实，获得转基因延熟果实,转基因延熟番茄,普通番茄,将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉，改变花卉的颜色，以提高观赏价值,异想天开：发光树能做路灯吗？,2.动物基因工程前景广阔,1）用于提高动物生长速度,2）用于改善畜产品的品质,3）用转基因动物生产药物,4）用转基因动物作器官移植的供体,1）用于提高动物生长速度,导入外源生长激素基因，使转基因动物生长得更快,2）用于改善畜产品的品质,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因奶牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低，其它营养成分不变。,3）用转基因动物生产药物,基因药物最理想的表达场所：,乳腺生物反应器,转基因动物的乳腺,乳腺生物反应器的操作过程,获取目的基因（例如血清蛋白基因）,构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）,显微注射导入哺乳动物受精卵中,形成胚胎,将胚胎送入母体动物,发育成转基因动物（只有雌性动物个体的乳腺中，转入的基因才能表达）,利用乳腺生物反应器产生的医药产品主要有：,抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、-抗胰蛋白酶等,利用乳腺生物反应器生产药物的优点：产量高；质量好；成本低；易提取。,4）用转基因动物作器官移植的供体,供体动物：,解决方法：,存在的难题：,猪,免疫排斥,将器官供体基因组导入，以抑制 的表达或设法除去，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官,某种调节因子,抗原决定基因,抗原决定基因,3.基因工程药物异军突起,基因工程药品包括：细胞因子（即淋巴因子如白细胞介素、干扰素等）、抗体、疫苗、激素等,利用基因工程制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品,4.基因治疗曙光初照,什么是基因治疗？基因治疗分为哪两种方法？用于基因治疗的基因种类有哪些？目前，基因治疗面临哪些问题？,基因治疗是把正常的基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病最有效的手段。,概念,体外基因治疗：体内基因治疗：,种类,从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。,直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。,用于基因治疗的基因种类A.从健康人体上分离得到的功能正常的基因B.反义基因：通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻断蛋白质合成。C.自杀基因：编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,神奇的基因芯片,拓展视野,1.4 蛋白质工程的崛起,.蛋白质工程的崛起的缘由2.蛋白质工程的原理3.蛋白质工程的进展和前景,1.蛋白质工程崛起的缘由,（1）基因工程的不足：在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质,(2)天然蛋白质的不足,天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要,对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？,蛋白质工程的概念,蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。,2.蛋白质工程的原理,基因DNA,mRNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质三维结构,预期功能,生物功能,转录,翻译,折叠,分子设计,DNA合成,中心法则,蛋白质工程,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包 括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？,3.蛋白质工程的进展和前景,有一定进展，但进展缓慢。前景诱人。,