基因功能分析策略.ppt

基因功能分析（Animal Genetic Engineering）,第十二章,主要内容,第一节 转基因第二节 基因敲除第三节 动物克隆技术第四节 RNAi技术,第一节 转基因技术（Transgenic technology）,1 转基因与转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。,概念转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。转基因动物：所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,Producing transgenic animals,Direct transfection or retroviral infection of embryonic stem cells followed by introduction of these cells into an embryo at the blastocyst stage of developmentRetrovial infection of early embryo Direct microinjection of DNA into oocytes,zygotes or early embryo cellsSperm-mediated transferTransfer into unfertilised ovaPhysical techniques such as biolistics or electrofusionNuclear transfer,转基因动物由于“外源DNA”导入而产生了可以遗传的改变。这些可遗传的改变包括：外源DNA片段至少整合到一条染色体的一个位点上；外源DNA的插入使基因组中任何一个基因的结构发生改变；外源DNA的插入使染色体发生重排；导入可以持久存在的遗传实体，例如，一条人工染色体或者可以自我复制并传递给子细胞的非染色体元件。,Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells,Introduction of methods,DNA Transfection Mediated by LipofectionCalcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAsCalcium-phosphate-mediated Transfection of Cells with High-molecularweight Genomic DNATransfection Mediated by DEAE-Dextran:High-efficiency MethodDNA Transfection Using PolybreneDNA Transfection by Electroporation,转基因的方法1、显微注射法：将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。2、体细胞核移植方法：先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。,Microinjection,用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因基因整合入动物基因组中，从而得到转基因动物。是目前常用的转基因方法。导入基因的速度快，操作简单，对DNA大小无限制。,Pronuclear microinjection,3逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。4胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。,转基因的方法,转基因动物的应用前景1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。,四个主要国家转基因作物种植面积占全球。美国占，达万公顷，转基因作物产量也居世界第一，美国种植的的大豆、的棉花和的玉米都是转基因作物。阿根廷占，达万公顷。加拿大占，达万公顷。中国第四位，占，达万公顷。欧盟国家总面积不到万公顷，.左右。,四个转基因作物种植大国2002年数据,各國GMO作物栽培面積的變遷(藍色者為全球統計),百萬公頃,Research on Transgenic Corn转基因玉米研究,改良玉米的质量保尔 斯科特博士，美国农科院和州立大学农学系教授在玉米上生产动物疫苗植物科学研究所生物药用研究所植物转化主任王侃博士基因限界,花粉散布的模拟农学系教授马克.维斯盖特博士非限制花粉流动（漂移造成的经济损失商学院教授德莫特 海斯博士遗传修饰农业产品生物安全研究所 种子科学中心主任满基特密斯瑞博士,Improving maize quality traits:Dr.Paul Scott,USDA-ARS and Department of AgronomyAnimal vaccines in corn:Plant Sciences Institute Biopharmaceutical Initiative:Dr.Kan Wang,Director Plant Transformation FacilityGene Confinement:Modeling Pollen Dispersal,Dr.Mark Westgate,Department of AgronomyEconomic Cost of Uncontrolled Pollen Flow:Dr.Dermot Hayes,Pioneer Chair of AgribusinessBIGMAP:Biosafety Institutefor Genetically Modified Agricultural Products,Dr.Manjit Misra,Director Seed Science Center,Dr.Scotts lab is using a combination of biochemistry,molecular biology and traditional plant breeding to add value to corn,斯科特博士的实验室综和利用生物化学，分子生物学和传统植物育种方法为玉米增加价值。,Maize quality traits玉米质量性状,Sows milk contains alpha lactalbuminAlpha lactalbumin protein is an ideal corn feed additiveDr.Scott eveloped transgenic corn to produce this protein in the seed Lines are being developed for feeding trials,母 猪 的 牛 奶 含-乳 清 白 蛋 白-乳 清 白 蛋 白是理想的玉米饲料添加剂斯科特博士的转基因玉米在种子中生产该蛋白含该基因的品系目前在饲喂试验中,alpha lactalbumin,Improving swine nutrition 改 良 猪 肉 营 养,Animal vaccines in corn玉米中的动物疫苗,王博士的研究小组研究转基因玉米产生有活性功能的抗大肠杆菌毒素的疫苗抗体该研究是州立大学植物研究所项目之一喂养老鼠含抗体的玉米使老鼠不受抗大肠杆菌葡萄球菌毒素和霍乱弧菌毒素危害,Dr.Wangs group developed transgenic corn plants that produce a fully functional vaccine antigen against an E.coli toxin.Part of the Plant Science Institute Bio-pharmaceutical InitiativeFeeding antigen-containing corn to mice protected them against E.coli enterotoxin and cholera toxin,E.coli,Scientific issues:Proof of concept,Genetic stabilityRegulatory requirements:Product comparability,puritySafety concerns:Environmental impact,Product protection,Gene flowCommercialization:Economic and Legal issues,科学领域:证明概念,保证遗传稳定性管理要求:产品的可比性,纯度安全性考虑:环境效应,产品保护和基因漂移商品化:经济和法律问题,Stewardship of Plant-Made Pharmaceuticals and Industrials 为植物产药用工业服务,目前世界上已經上市並商品化的转基因植物有：黄豆、玉米、棉花、木瓜、甜菜、油菜、水稻、小麦、马铃薯、凤梨等。,由外观无法判断木瓜是否基因改造,世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。,转基因番茄 1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。,转基因甜椒,甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转基因油菜 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。,玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。,转基因玉米,抗虫害的玉米,转基因小麦 从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。,基因改造兰花,台湾的兰花经基因重组技术而延长开花时间。,利用基因重组技术培育新颜色的海芋，引起争议较小。,转基因牵牛花,我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。,存在问题1、食品安全问题：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人体内表达？2、技术问题：1）成本；2）成功率；3）基因组的有效整合、稳定遗传；,什么是生物反应器？生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。,用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。据预测，2010年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到500亿美元以上。,生物反应器的种类及应用,第二节 基因敲除(Gene Knockout),什么是基因敲除技术？基因敲除（gene knock out）是80年代初出现的一项新的基因工程技术。采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。,基因打靶,基因打靶(gene targeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。基因打靶的特征：直接性。准确性。有效性基因敲除(gene knockout)：定向敲除某个基因的方法。基因敲入(gene knockin)：定向将一段基因序列替代另一段基因序列的方法。,基因打靶的必备条件,胚胎干细胞(ES细胞)取自胚胎早期的内细胞团。ES细胞能在体外培养，并保留发育的全能性。打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),基因打靶策略,完全基因剔除基于Cre-LoxP重组酶系统的条件基因打靶用基因打靶技术引入精细突变大片段染色体的重排和删除随机基因删除ENU诱导点突变与大规模基因突变和功能研究利用基因敲入技术制备转基因动物,基因敲除的基本程序,打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种,示例,基因敲除技术的应用1、研究基因调控和基因功能；2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；4、治疗遗传病，即基因治疗。5、改造生物、培育新的生物品种。,用基因治疗血友病,第三节 动物克隆技术(Animal Cloning Technology),Creating Dolly！,1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。,1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。,多莉的生命历程,罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内。科学家共培育277个胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降临人世。直到1997年2月23日才公布于众。,克隆猪,Cultured pigembryosfollowing thenuclear transfercloningprocedure.,ANDi 第一只转基因灵长类,Transgenic but not fluorescentCarries and expresses the GFP transgeneFluorescence is not detectedShows gene modification in primates is possible,克隆灵长类（Cloning Primates）,Cloned and aloneNeti(nuclear embryo transfer individual)Ditto are still the only cloned primates,despite years of effort by several groups.,能发荧光的热带斑马鱼,普通热带斑马鱼是不发荧光的,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长效应。,我国培养的转基因兔，转入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔体内整合并表达。,兔研人员将乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。,美国通过基因工程将人的基因植入牛的体内，由转基因公牛授精的母牛产下5头健壮的牛犊，每头都含有一个人类的基因。,转基因动物,不同转基因动物研究水平,绿色=常规黄色=发展中红色=还不可行,什么叫克隆？细胞核移植得到的个体都叫做克隆。核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。根据核供体的来源不同，可将其分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术。通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖。,动物克隆的意义,1、体细胞与胚胎干细胞的相互转化,胚胎干细胞,体细胞,动物克隆的意义,2、对传统动物繁殖模式的挑战；（AI、Clone）3、对社会伦理的挑战；,4、保存物种、延续生命、提高人口素质？,第四节 siRNA 技术(siRNA Technology),什么是RNAi？,RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。一种转录后水平的基因沉默生物体内普遍存在抵御外在感染的重要保护机制,RNAi的发展历程大事记,1995，RNAi现象首次在线虫中发现。Cell，1995，81：611-6201998，RNAi概念的首次提出。Nature,1998,391（6669）：8061999，RNAi作用机制模型的提出。Cell，2000，101（1）：25-33 在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现 RNAi现象。2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉 默现象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技术被Science评为2001年度的十 大科技进展之一。2002至今，有关RNAi的研究蓬勃开展，是分子生物学领域最为热门的方向之一。,预备知识,dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链Dicer：属于RNase 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA：small interfering RNA，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNARISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递,RNAi引发的基因沉默机制,Gisela Storz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,RNAi的分子生物学特性,RNAi是siRNA介导的转录后水平的基因沉默RNAi作用针对的是靶基因的外显子序列高特异性，只针对同源靶向mRNA高效性，极低浓度的siRNA就能完全抑制基因表达RNAi作用具有可传递性,RNAi研究的一般技术路线,RNAi的研究方法,siRNA的设计根据靶向mRNA进行设计目前已证实的siRNA序列 http:/http:/web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html互联网上的帮助 http:/http:/,RNAi的研究方法,siRNA的制备方法体外制备-化学合成siRNA-体外转录合成siRNA-用RNase 消化长片段dsRNA得到siRNA体内表达-利用质粒或病毒载体表达siRNA-PCR方法制备siRNA的表达框架,siRNA制备方法比较,应用,基因功能研究基因治疗-基因缺陷-病毒感染-肿瘤疾病其它应用-植物代谢-细胞信号传导通路,（1）在功能基因组中的应用,在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为RNAi技术。根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。,（2）在基因治疗中的应用,治疗HIV 感染由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV 1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA，Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等针对HIV病毒gag基因设计的siRNA，其基本策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因为靶点。,治疗HIV 感染,然而，RNAi治疗HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决：、作用靶点的选择，siRNA对序列要求非常严格，1个碱基的错配，将大大降低siRNA基因表达抑制作用。如果HIV逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为siRNA的设计和合成增加了难度。、如何有效导入siRNA.DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。、增强siRNA在细胞中的稳定性.为了防止细胞内RNA酶对siRNA的降解，可以用DNA质粒和病毒载体将siRNA以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。,治疗肝炎病毒感染,Jude Lieberman等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA，发现有90的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40在天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。,治疗肝炎病毒感染,McCaffre A及其导师Kay M结果则证明RNAi可以直接治疗肝炎并病毒。他们首先将HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，模拟HBV感染，然后合成靶向HBV基因组不同部分的2种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对照组相比减少了92%。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。但Kay指出，这种运送siRNA方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。,治疗肿瘤,多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA。Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因k ras(v12)的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。Scher 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr ab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取得了成功。因此基于 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。,基因调控,目前在人、蠕虫，果蝇和植物等生物体中都发现了小RNA，有的通过结合3非翻译区（UTR）和靶mRNA抑制mRNA翻译，有的作为siRNA通过RNAi机制破坏靶基因转录本。,