土壤中分解尿素的细菌分离和计数.ppt
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,微生物的培养与应用,分离产生脲酶的细菌,尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。,只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,课题背景,课题目的,土壤中尿素分解菌的分离与计数,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土样中究竟含有多少这样的细菌,思考：PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93 左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？()A土壤中 B海水中C热泉中 D冷库中,C,如何寻找耐高温的酶？寻找高温环境；原理：热泉70-80的高温条件淘汰了绝大多数的微生物，使得耐热的Taq细菌脱颖而出。选出耐高温细菌后，从耐高温菌种中提取耐高温酶。,1、自然界中目的菌株的刷选原理：,一、筛选菌株,2、实验室中筛选微生物的原理：,（纯且活的菌种）,在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去找。,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？此配方能否筛选出分解尿素的细菌？为什么？,?,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,3、方法：,利用选择培养基分离,选择培养基：,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,(1)在培养基中加入某种化学物质。,利用选择培养基分离微生物的方法：,例如，加入青霉素可以分离出；加入高浓度的食盐可以得到。,酵母菌和霉菌,金黄色葡萄球菌,这里的加入是在培养成分的基础上加入。,(2)改变培养基中的营养成分。,例如，缺乏氮源时可以分离；尿素作为唯一氮源时，可以分离出 石油作为唯一碳源时，可以分离出,固氮微生物,能消除石油污染的微生物,能分解尿素的细菌,(3)改变微生物的培养条件。,例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到,耐高温的微生物,本课题使用的培养基的配方如下：,请分析后回答：(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_和_。(2)该培养基为_培养基(按物理状态分)，理由是_。(3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？_ _。,葡萄糖,尿素,固体,有凝固剂琼脂,有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长,二、统计菌落数目,1、方法：,常用稀释涂布平板法统计活菌的数目,原理：,当样品的 时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的。,为了保证结果准确，一般选择菌落数在 统计,通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少的活菌。,要求：,30300 个菌落的平板,稀释度足够高,一个活菌,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了一个平板，统计的菌落数是230B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233,因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数表示。,=（平均菌落数涂布的稀释液体积）稀释倍数。,缺点：,操作复杂，实验结果有一定的误差。,统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,每克样品中的菌株数=（C/V)X MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,计算公式：,显微镜直接计数,优点：缺点：,计数方便，操作简单,死菌、活菌都计算在内，统计结果比实际值偏大,（统计菌株数目）,1、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）A 一个细菌、液体培养基 B 许多细菌、液体培养基C 一个细菌、固体培养基 D 许多细菌、固体培养基2、某同学在稀释倍数为106 的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）A 2.15108 B 2.15109 C 215 D 21.5 3、下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中，不正确的是（）A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板C 将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养24h-48hD 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。,C,B,D,利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,?,方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。,2、增加实验说服力的措施：,排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,设置重复：,排除偶然因素对实验结果的影响。,在培养过程中同一稀释度下应涂布至少3个平板，才能增强说服力和准确性,设置对照：,若对照的培养皿中无菌落生长，说明：,方法：,方法：,观察培养物中是否有杂菌污染,如空白对照组,培养基未被杂菌感染,培养基混入其他杂菌,若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：,若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目，说明：,观察选择培养物是否具有选择作用,如完全培养基对照组,选择培养基具有筛选作用,距地表约38cm土壤层,三、实验设计,1、实验流程：,2、操作流程：,（1）土壤取样,取样原因：土壤要求：取样部位：,土壤“微生物的天然培养基”，含有大量的微生物，数量最大，种类最多。,富含有机质，pH接近中性且潮湿。,测细菌数：测放线菌：测真菌数：,（2）样品稀释,稀释原因：稀释标准：稀释倍数：,样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目,选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30-300之间，便于计数。,一般用104、105、106稀释液,一般用103、104、105稀释液,一般用102、103、104稀释液,思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？,土壤中各类微生物的数量不同如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围可以放宽103-107.,1、关于土壤取样的叙述，错误的是（）A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B 先铲去表层土3-8cm左右，再取样C 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D 应在火焰旁称取土壤2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列正确的是土壤取样称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中吸取0.1ml进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度A B C D,C,C,（三）微生物的培养与观察 1、接种：用适当的稀释液涂布平板 2、培养：细菌：3037，12d;放线菌:2528,57d;霉菌:2528,34d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目 b.以“稳定菌落”为观察对象,（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红,为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是；然后，将水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为。,(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过 灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是。(3)示意图A和B中,表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中 的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。,
