同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用.ppt
第14章.同位素标记技术在分子生物学实验中的应用,中国农业大学齐孟文,标记探针,探针（proble)带有检测标记的，与被检测目标物分子具有特异性互补反应性能的探测物分子或分子片断。探针类别 核酸探针 DNA、RNA 探针 非核酸探针，抗体、蛋白质分子标签等,核酸探针,标记类别,标记核素,标记单体,掺入DNA探针的常用单体标记化合物-32pdATP，-32pdCTP，-32pUTP，-32pATP。国内供应商：北京福瑞 国外供应商：UK,标记单体,在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的位磷酸整合到核酸链中，因此使用 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如-32 PdATP。而在标记 5 末端磷酸基团的反应中一般使用位磷酸被标记的 ATP。放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。,核酸探针标记法,1.双链DNA探针 切口平移法 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后借助于E.coli DNA聚合酶I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的探针。切口平移反应受几种因素的影响:(a)产物的比活性取决于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b)DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。,切口平移法,(2)随机引物法 通过热变性使模板DNA 变为单链DNA，随机引物与单链DNA退火后，利用Klenow Fragment合成互补链。此时如果底物中dNTP的一种或几种被-32P,-35S,3H 等标记时，那么合成的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热变性变成单链后即可用作杂交探针。,随机引物 法,DNA标记法比较：,2.单链DNA探针,从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。将模板序列克隆到M13噬菌体,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸为引物，在-32PdNTP存在下，由Klenow片断 酶促合成标记探针，反应完毕后，酶切长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳与模板分离。,从RNA合成单链cDNA探针 用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:a.寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。b.可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。,3.寡核苷酸探针,若只知道待分离的目的基因编码的蛋白质产物，而对其核苷酸序列一无所知，即可设计合成寡核苷酸探针。利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。单一已知序列的寡核苷酸探针.种类 许多兼并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库.,4.RNA探针,许多载体如pBluescript,pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的dNTP，则可合成RNA探针。RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。RNA:RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果。,5.末端标记,（1）一种是在5末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。,6.PCR 扩增标记,在PCR扩增时加入标记的 dNTP，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。,标记一般流程,核酸分子杂交,互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。,杂交类型,Southern杂交,DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:(1)酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。,检测灵敏 Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(109 cpm/g)互补DNA。如果将10g基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。,带有DNA片段的凝胶,Southern 印迹杂交的技术流程,电泳示意图,凝胶电泳,转印方法(1)毛细管虹吸 优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转印 将DNA变性后,经电泳印移至带电荷的尼龙膜上。优点是可直接转移较大的DNA片段，缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管和真空转移无效时,才予以采用。(3)真空转移 一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,在洗膜不严格时,其背景比毛细管法的要高。,虹吸印迹,分子杂交炉,杂交过程,成像观测,放射性自显影 利用标记核素自身的放射性射线使感光材料感光成象的过程。目前常用的方法有:传统的胶片自显影 感光屏：医用X光片；原理：爆光过程，射线粒子使X光片乳胶基质中均匀分布的溴化银晶粒感光形成物点的潜影，然后经显影及定影得像图。胶片影象可在底片上直接观察。,X光自显影暗盒及图像增强屏,成像观测,储存磷光屏（storage phosphor screen）一种由磷光晶体制成的影像屏（Imaging Plate)。经射线爆光后IP以潜能储存射线能，当在读取装置下扫描读取时，IP在扫描激光下释放潜能发出蓝绿光，光强与爆光时射线强度成正比，用光电传感器转换电信号，再经模数转换成二进制编码信号，由计算机成象系统合成为影象图。操作：用塑料薄膜盖电泳凝胶，贴附于装于暗盒的磷光屏曝光，然后在成像仪上，通过扫描磷光屏上储存的光能进行成象。,UVI化学发光凝胶成像系统,与著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系统是一样，台风储磷技术-磷屏Typhoon9000系列能对所有电离辐射源提供高分辨率图像并精确定量：3H32P14C 33P125I 35S18F99mTc大成像面积，高分辩光学系统和灵敏的磷屏组合，为您提供可靠的实验结果。下图给出的是用32P标记的AtlasTM 微阵列(macroarray)在GP屏上的图像。,成像观测,闪烁光纤屏 由塑料光纤制成的板，光纤中填有铅和发光染料，使射线能转换为可见光光子，然后再由电荷耦合器件CCD摄像机成像。较胶片和磷光屏的分辨率好，近实时成像且需曝光量低。,成像观测,放射性薄层扫描仪 由空间位置灵敏探测器组成核探测仪器。可用于薄层层析板、凝胶电泳转印膜上放射性条带的直接定位测定。,美国的Bioscan公司 AR-2000图像扫描仪,AR2000图像扫描仪可对所有类型同位素（包括3H）标记的TLC板、凝胶、印迹进行直接定位定量计数测量。扫描仪采用充气式计数器，可检测和射线的同位素。对整块薄层层析条带的扫描可在1分钟内完成。整套系统包括一个仪器控制和数据采集软件，扫描结果以层析图或2D图像显示，自动完成对峰的定量，并以多种方式显示结果。应用于TLC板、凝胶和印迹不需破坏TLC板即可进行定量对所有类型同位素（包括3H）灵敏简单易用的WinScan软件快速、自动、可靠的运行提供出色的空间分辨率针对1、2、3块TLC板可选择不同的型号2-D彩色图像主要应用于放射化学纯度、脂类生物化学、代谢研究、酶分析、毒理学研究等领域。,瑞士卡玛 产地：德国,同位素薄层扫描仪 技术参数扫描面积为 400200 mm（Gita,Rita）50200mm(mini Gita,mini Rita)扫描速度：可选 轨道数目：1-80 检测器：-radiation(BGO detector)，-radiation(GM counting tube)，gasflow 检测能量范围：0-2000KeV 可检测的放射物:-radiation(BGO scintillation probe)背景:129I:0.7 cps(20-100 KeV)灵敏度:129I:20 Bq in 10 min 分辨率:129I:2-3 mm(depending on the used collimator)可检测的放射物:-radiation open proportional counting tube(Recommended for 3H-requires counting gas P10=90%Ar 10%Ch4)背景:18F:0.1 cps 灵敏度:18F:10 Bq in 10 min 分辨率:18F:1-2 mm,防护措施,INSPECTOR,Northern杂交,Northern杂交与Southern杂交很相似,主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性剂主要有3种:乙二醛，甲醛，羟甲基汞。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。,菌落原位杂交,对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4直至得到筛选结果。,菌落原位杂交,斑点杂交,斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。,DNA序列分析,Sanger双脱氧链终止法 Cambridge的F.Sanger于1977年发明。基本原理：DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，准确合成的DNA互补链；该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无53外切酶活性。,DNA序列分析,Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)对一个末端标记的DNA片段，用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段。把反应分为四组，每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基，并且要保证每个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰，这样，在每一组反应中都在同一个或两个核苷酸处DNA链发生断裂，由于碱基位置不同，就会产生一组不同长度的DNA片段。最后，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后就可读出待测DNA的核苷酸序列。,化学修饰法,Maxam-Gilbert法所用的化学修饰技术,DNA序列分析,DNA序列分析自动化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。,荧光标记物,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,单泳道电泳及信号收集,正极,负极,计算机排序,5,GS FLX系统超高通量测序技术原理 GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。,GS FLX系统的操作过程 GS FLX系统提供了完整的从样品制备到后续的生物信息学分析解决方案。1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3和5端具有特异性）连接到DN*段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DN*段。,GS FLX系统的操作过程 4）一条DNA片段一个磁珠：接头使成百上千条DN*段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DN*段进行平行扩增。5）一个磁珠一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DN*段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。,备注,焦磷酸测序(pyrosequeneing)是通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测的测序技术。既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核昔酸多态性(single 年nueleotide polymohism，SNP)检测及等位基因频率测定。焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5-磷酰硫酸(adenosines 5phosphosuifate，ASP）,备注,和荧光素。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。在每一轮测序反应中，加人1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺人到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由PyrogramMT转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。根据加人dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核昔酸序列。,DNA序列分析,DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，则可认为靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的探针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。,DNA杂交测序法,SBH的应用：可有效检测靶DNA中的单碱基突变；可用于不同DNA片段之间的序列比较；可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；可用于检验传统测序技术的准确性。,蛋白质研究技术,Western免疫印迹 将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,WB,PCR应用,1.PCR技术的原理 无细胞克隆法：以拟扩增的DNA片段为模板，一对分别与模板互补的寡核苷酸为引物，在4种脱氧核苷酸（dNTP）存在下，由DNA聚合酶在引物所结合的位置向3方向合成新的互补链。其反应以双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25-30次），便目标DNA片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。,Mullis的PCR构思,预变性(93-95C,2-5m),变性(93-95C,30s),复性(50-70C,30s),延伸(75C,30-60s),总延伸(75C,7m),(25-35),PCR的一般过程：,经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。,PCR技术的原理,PCR步骤:（1）高温变性，双链DNA变性（9095）成为单链；（2）低温退火（37-60），引物与单链DNA互补序列结合；（3）适温延伸，DNA聚合酶催化（70-75）使引物延伸。（4）重复（1）-（3）步。,PCR技术的原理,实验材料、仪器和试剂 1.材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2.仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3.试剂：10XPCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2,PCR操作步骤,1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L,2.PCR循环,PCR仪,3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。,PCR操作步骤,PCR应用,PCR应用,2.与标记相结合的应用LP-PCR(labelled primers)利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，可用以直观的检测目的基因，特别适合于临床基因诊断，同时可以检测多种基因成分。,PCR应用,2.与标记相接合的应用原位PCR(Is-PCR)以整个细胞作为反应体系，对目的基因进行扩增，然后通过原位杂交等不破坏细胞结构的方法进行检测的方法。其检测标本一般为细胞涂片或组织切片，适合低拷贝靶序列的检测。可用于细胞内的病毒感染、基因重排，以及基因表达的检测。,
