双向免疫扩散试验.ppt

,实验三 双向免疫扩散试验,一 目的要求,1.复习巩固免疫化学的基本知识2.熟练掌握免疫扩散法的操作步骤3.掌握其在抗血清效价的测定和特异性 抗体的分析中的应用,二 实验原理,琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀；沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动；沉淀带形成一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允许不同的分子通过。,沉淀线的特征与位置：1 抗原、抗体的特异性和浓度，2 抗原、抗体分子的大小 3 扩散率 当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。,1.双扩散用于疾病诊断：以IBD诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原。2.双扩散用于抗体检测：以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清、IBD阴性血清、待检血清。,三 操作步骤,1琼脂玻板的制备梅花型打孔图 将溶化的1.5%琼脂倒在培养皿中，使之能将表面覆盖，制成厚度约23mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔。（切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。）,2免疫扩散及结果观察,注意：加样至孔满为止，不可外溢。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中。湿盒于37中，一般保温2448h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。,每孔加入抗原/抗体10l,四 结果记录,五 讨论,试讨论以上六种情况中抗原和抗体的浓度差异以及在凝胶中的扩散率大小（用、表示）,实验四 火箭免疫电泳,【目的要求】,1.复习巩固免疫化学的基本知识2.熟练掌握火箭免疫电泳的操作步骤3.掌握其在抗血清效价的测定和特异性抗体的分析中的应用。,【实验原理】,在电场作用下，抗原在含定量抗体的离子琼脂糖中泳动后，如二者比例合适时，可在短时间内出现锥形的沉淀峰，形似火箭状，故又称为火箭电泳。此沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比，与抗体的浓度成反比。,【操作步骤】,1.琼脂糖玻板的制备 30ml 1.5的琼脂糖悬液（0.45g琼脂糖+0.025M的巴比妥缓冲液）微波炉溶解等温度降到56时加入200l抗体浇制琼脂厚度为12mm抗体琼脂板。,2.抗原在稀释板中倍比稀释 1/1、1/2、1/4、1/8、待测样品,3打孔、加样火箭电泳试验示意图 待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。电泳前各孔中加入抗原液，每孔20L。4电泳：250伏1.5小时（滤纸搭桥）5结果判定 电泳结束后，取出琼脂板，加1鞣酸生理盐水浸泡后30分钟，观察与测定结果。,四 结果,五 讨论,试分析沉淀峰出现云雾状或圆形的原因及解决方案。,