分生实验4：质粒的提取和电泳.ppt
,目的 DNA片段,质粒,TA载体,连接,重组质粒,目的 DNA,转化,无质粒的E.Coli 死亡,有质粒的E.Coli 存活,含抗生素培养基中生长,重组质粒的鉴定,PCR,开始上课时介绍2-3min,平板筛选,上次实验小结,1、观察自己组的实验结果：转化平板*培养板在37C 培养12-16h卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞,o,小量制备质粒和电泳分析,实验四,开始实验操作前：本次实验介绍10-15min,质粒,质粒载体,是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状,筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点,质粒,1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。,质粒提取原理：,质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：,去除蛋白质,去除基因组DNA,去除RNA,*酚-氯仿抽提法,*RNase消化,？,质粒DNA与基因组DNA的区别,大肠杆菌遗传物质,1、部位不同：2、大小不同：,质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106 bp。基因组DNA容易断裂线性化,碱裂解法提取质粒的原理,原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.,1)细胞悬浮液（溶液I）-悬浮菌体50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.010 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.02)细菌裂解液（溶液II）-裂解菌体0.2mol/L NaOH1%SDS,碱裂解法提取质粒试剂：,3）中和液（溶液III）-中和NaOH60 ml 5mol/L 醋酸钾11.5ml 冰醋酸28.5ml 水4）20mg/ml RNase-降解细菌RNA工作浓度3050 g/ml其他试剂作用和成分同实验一。,质粒DNA的制备,录像5分钟：（8：208：25）,（1）（细菌的收获：）取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min，弃上清。（2）（细菌的裂解：）加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置 冰上 5min，12,000转/分，4离心 5min。,碱裂解法提取质粒操作步骤,开始操作：,（去除蛋白质）（4）将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000转/分 离心 5min。（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20沉淀1015 min。,上午实验结束,下午实验内容,继续提取质粒：获取及溶解沉淀的质粒DNA,2质粒DNA电泳分析：,（7）12,000 转/分离心5min。弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。（去除RNA）（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA，轻轻吹打混合。37 保温10min,20 l质粒DNA溶液,取出10 l放于另一个离心管中备用,剩余10 l用于下一步酶切,继续实验操作,取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：100V 40min。电泳结束后照像保存，结果分析。,质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳,质粒提取方法,质粒的量,质粒的纯度要求,决定使用不同的方法,质粒的大小,质粒过大：温和裂解,质粒大小适中：碱裂解，煮沸法,如：,如：,大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂,小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法,质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等（满足各种转基因实验的要求）要求不同的纯化方法,电泳时讲授10-20min,方法举例：,经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心,特点：纯度最高（可获得高质量的超螺旋质粒DNA）、最贵、最麻烦,应用：大量制备质粒；基因注射，基因转染等对质粒质量要求高的实验,缺口环状或线状DNA,闭环质粒DNA,原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置,特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提）,质粒提取试剂盒,常用方法：小量碱裂解法,满足不同需要的试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备质粒kit,大量制备质粒kit,去除内毒素制备质粒kit,可用于大部分分生实验,质粒的电泳,质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.,开环,超螺旋,线性,重组质粒的鉴定,平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞,提取的质粒,质粒电泳筛选重组质粒,重组质粒的进一步酶切鉴定,质粒电泳,空质粒,重组质粒,重组质粒分子量变大而在电泳中滞后,质粒酶切电泳,a:酶切前,b:酶切后,插入片段,注：观察质粒的电泳带型 分析质粒切不开的原因。,
