凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量.ppt
实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量,【目的要求】,掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能,【原理】,凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,图3-1 凝胶层析分离原理示意图,【基本概念】,外水体积、内水体积、柱床体积、洗脱体积 外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。,【基本概念】,洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积 Ve Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve Vt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,图3-3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子 中等分子 完全渗透的小分子,洗脱体积的测定,外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定 即 VeVoVi 推出 Vi Ve Vo 柱床体积（Vt）：1)可用下式计算：Vt（D/2）2h 2）根据 VtVoVi 可以得到 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。,分配系数表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。,Vo 和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve 就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先从柱中流出Ve值小Kav值小 小分子后从柱中流出Ve值大Kav值大,Kav,Ve Vo,Vt Vo,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。,对于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 对于完全渗透的小分子 Ve Vt 故 Kav 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：Kav blgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有：Ve blgMr+c,通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。,吸水率和床体积,吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。Sephadex G-25200 数字是吸水率10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如SephadexG-75 床体积 1215 ml/g 干胶用量(g)=柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g),【应用】,生物大分子的纯化分子量测定脱盐及去除小分子杂质去热源物质 溶液的浓缩,【操作方法】,一、凝胶的选择和处理量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中，加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。二、装柱 1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt。,3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约23高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速36mL/10min，用 23倍柱床体积的洗脱液平衡。,三、Vo 的测定,打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗脱峰，测出洗脱体积Ve，得出Vo值。,1）用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、溶菌酶）。2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质的Kav值。4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出标准曲线。,四、标准曲线的制作,五、未知样品蛋白质分子量的测定,将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve，代入公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。,六、实验结果与分析 实验结果填入表中,结果分析,绘制蓝色葡聚糖洗脱曲线 绘制标准蛋白质洗脱曲线 绘制鸡卵粘蛋白样品洗脱曲线 绘制lgMr-Kav标准曲线,确定待测样品鸡卵粘蛋白 相对分子质量.,谢谢同学们,
