皮肤科细胞培养及临床应用.ppt
皮肤病学相关研究中所涉及的细胞培养问题,中国医学科学院皮肤病研究所李新宇2004年2月,2023/10/7,1,细胞培养涉及的基本知识,2023/10/7,2,最常见的两种生长型细胞,贴壁依赖性细胞(Anchorage-dependent cells)贴附于不起化学作用的物质(玻璃、或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞(Suspension culture)细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。,2023/10/7,3,细胞培养中常用的几个术语,细胞系(Cell line)：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。连续传代 连续传代 连续细胞系 有限细胞系(已建成的细胞系),2023/10/7,4,细胞株(Cell strain):由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。细胞周期(Cell cycle)细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。4个时期：S期：DNA合成期 M期：有丝分裂期 G1期：有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G2期：DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G0期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入 休眠状态,2023/10/7,5,细胞一代时间(Cell generation time)单个细胞两次连续分裂的时间间隔。群体倍增时间(Population doubling time)在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所 需要的时间。,2023/10/7,6,克隆(Clone)单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。细胞融合(Cell fusion)体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞(Hybrid)。细胞汇合(Confluence)器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。,2023/10/7,7,原代培养(Primary culture)从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的 培养。传代培养(Passage)(Subculture)细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿 中培养。再培养(Reculture)单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基 中的过程。,2023/10/7,8,集落形成率(Plating efficiency)细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。单个细胞 集落 克隆形成率(Cloningefficiency)群体密度(Population density)培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数(细 胞数/cm2)。饱和密度(Saturation density)特定条件下，培养器皿中能达到的最高细胞数(细胞数/cm2或细胞数/cm3)。,2023/10/7,9,培养基,培养基 天然培养基 合成培养基 基本培养基(通用培养基)(MEM)无血清培养基 无蛋白培养基 血清基本培养基(通用培养基)完全培养基,2023/10/7,10,基本培养基的组分 四大类物质 无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 pH指示剂 酚红,2023/10/7,11,常用基本培养基 RPMI 1640 应用最广泛 DMEM 高糖型 4500g/L 葡萄糖，低糖型 1000g/L葡萄糖 HamF12 无血清培养基常用的基础培养 基 199,2023/10/7,12,培养基的选择 培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择,2023/10/7,13,培养基配制时的注意事项 严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES-各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存,2023/10/7,14,培养基添加成分 NaHCO3 一般按说明书要求添加 封闭式培养用5.6%或7.4%液调节 谷氨酰胺 易降解，使用前添加 使用终浓度0.002mol/L HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)主要作用为防止培养基pH迅速变动 使用终浓度0.01-0.015mol/L,2023/10/7,15,完全培养基的添加成分,牛血清 小牛血清：取自出生1030天的小牛。新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛。胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方 法获得。,2023/10/7,16,血清的主要作用 提供细胞生长所需的基本营养物质。(激素、生长因子、结合蛋白)提供贴壁和扩展因子(纤连蛋白,层粘连蛋白)。对培养中的细胞提供保护作用。抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用 终止贴壁细胞消化传代中所用胰蛋白酶的作用 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机 械损伤,2023/10/7,17,使用血清的缺点 改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长。所含物质对细胞生长的影响或毒性作用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性,2023/10/7,18,血清质量的判断 质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测)克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养 外观判断 透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较粘稠,2023/10/7,19,血清的使用与贮存 灭活处理:56水浴,30分钟(去除补体)贮存条件:分装-20 长期贮存,避免反复冻融 4,1个月 融化步骤:-20 4 室温 使用浓度:5%20%,常用10%临用前添加于培养基中,2023/10/7,20,无血清培养基,用途 观察生长因子对细胞的作用,需排除其它生长因子的干扰作用 测定细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力 大规模培养细胞，获得分泌产物,2023/10/7,21,无血清培养基的组成 基础培养基 HamF12:DMEM=1:1 添加组分 促贴壁物质（细胞外基质，如纤连蛋白,层粘连 蛋白）促生长因子及激素 酶抑制剂（终止胰酶消化作用，保护细胞，如大 豆胰酶抑制剂）,2023/10/7,22,更换无血清培养基的注意事项 针对性强 直接适应 连续适应 逐步降低血清浓度,2023/10/7,23,无蛋白培养基(PFM)不含动物蛋白的培养基，以添加植物水解物替代动物激素、生长因子。用途 生物技术产品生产,2023/10/7,24,限定化学成分培养基(CDM)培养基中所有成分明确，不含动物蛋白，也不添加植物水解物，而使用一些已知结构与功能的小分子化合物(短肽、植物激素等)。用途 分析细胞分泌产物,2023/10/7,25,细胞培养中的其它用液 平衡盐溶液 PBS Hanks液 D-Hanks液-,2023/10/7,26,消化液 胰酶溶液(0.10.25%)D-Hanks液配制 最佳pH值：89 EDTA溶液(0.02%)用于解离细胞(破坏细胞间的连接)与胰酶混合用于消化贴壁牢的细胞 胶原酶溶液(0.10.3mg/L)不易损伤细胞，不受Ca2+、Mg2+及血清抑制,2023/10/7,27,细胞培养的生长测定,血细胞计数法 细胞密度(个/ml)=平均细胞数104 稀释倍数 影响方法精确性的因素 贴壁细胞消化的时间 细胞悬液的均匀性 细胞浓度合适,2023/10/7,28,台盼蓝染色法 正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。细胞活力(%)=(总细胞数-着色细胞数)总细 胞数100%注意 为一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确放映细胞活力差异。判断时间,2023/10/7,29,MTT比色法 活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮 唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积 于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于 酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形 成的多少与活细胞数目和功能状态相关。细胞存活率=试验组光吸收值对照组光吸收值100%MTT法特点 高浓度血清的影响 简便迅速。不接触同位素，敏感性与同位素法接近。,2023/10/7,30,细胞生长曲线法 可观察同一代细胞的增殖过程。根据生长曲 线分析细胞增殖速度，确定具体实验细胞传 代的最佳时间。方法 总培养时间7天 计数每24小时细胞数目 绘制细胞生长曲线 潜伏期 原代细胞24-96h 传代细胞6-24h 对数生长期 3-5d 倍增时间 停滞期,2023/10/7,31,3H-TdR掺入法 3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合 成的DNA 中，通过测定3H放射性脉冲数，计 算细胞的增殖活性。特点 被标记的细胞为S期细胞，3H-TdR掺入量放 映DNA合成的快慢。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。,2023/10/7,32,细胞培养中的传代换液问题,原代培养后的第一次传代 原代培养方法 细胞活性 细胞类型和特点 接种密度 培养条件常规传代 传代时间 对数生长期 传代比例 原瓶细胞分于2-4瓶 贴壁细胞酶充分消化,2023/10/7,33,二.角质形成细胞培养问题,2023/10/7,34,角质形成细胞培养方法 组织块培养法 3T3细胞为滋养层培养法 胶原为滋养层培养法 气液交界面培养法 无血清培养法,2023/10/7,35,组织块培养法 将表皮块贴附在培养瓶壁上,角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。特点 稳定可靠 获得的细胞数量有限 细胞生长周期长 成纤维细胞污染,2023/10/7,36,3T3细胞滋养层培养法 3T3细胞经丝裂霉素C或-射线预处理(失去分裂增殖功能)后,低密度接种在培养瓶壁上,再将角质形成细胞种植在此细胞滋养层上。3T3细胞 小鼠胚胎瘤成纤维细胞株 滋养层作用 促使角质形成细胞的贴附和生长,并形成集落,最后融合成复层鳞状上皮 接触性抑制成纤维细胞生长,2023/10/7,37,3T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径:产生基质成分,促进角质形成细胞贴壁。分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子。通过细胞间相互作用,调节与角质形成细胞增殖相关的生 物因子。,2023/10/7,38,3T3细胞滋养层培养法特点 细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。3T3细胞逐渐被挤压,随着角质形成细胞集落不断扩大形成冠状,然后被压缩成条索状,最后脱落且消失。3T3细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,用它作为滋养层培养的人角质形成细胞或人工表皮,移植后可能引起异种排斥反应。培养过程中角质形成细胞角化明显。改进法：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内 cAMP水平的试剂（霍乱毒素等）。,2023/10/7,39,胶原滋养层培养法 角质形成细胞的贴壁率 玻璃培养瓶 2.8%7%,塑料培养瓶 14%预铺胶原的塑料培养瓶 70%80%,2023/10/7,40,胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制 细胞外基质的主要成分,促进细胞贴壁。覆盖培养瓶壁上不利于角质形成细胞粘附、生长的化学基团。为角质形成细胞提供粘附所需的特异性化学基团。为角质形成细胞的生长提供必要营养。,2023/10/7,41,气液界面培养法 使表皮细胞在更接近正常人体的生理状态下生长和分化。培养皿内加上一层铺垫,再将皮肤角质形成细胞接种其上,加入的培养液不超过铺垫水平,细胞通过铺垫吸收营养维持其生长发育。(接种在铺垫上的细胞先进行浸泡性培养，一定时间后铺垫支架升到气-液界面继续培养，使角质形成细胞完成终末分化。),2023/10/7,42,铺垫 动物或人的尸体的皮肤真皮 玻璃纤维片 胶原膜或尼龙网 胶原膜和尼龙网的贴合物。Transwell培养皿特点 能培养出多层类似正常皮肤的细胞层次，与正常皮肤非常接近。,2023/10/7,43,无血清培养法 含血清的传统培养方法特点 必须在培养液中加入一定比例的血清以利于 细胞生长,但所含因素变化大,不明因素多,成份 复杂。影响角质形成细胞生理和病理生理等的精细 研究(对表皮细胞的生长调节机制,培养表皮细胞因子的释放,特殊抗原和受体的表达研究等)。,2023/10/7,44,无血清培养法特点 技术要求较高。培养基中需添加牛脑垂体提取物(WBPE)或猪脑垂体提取物(PWPE)。排除了复杂的血清成分对人角质形成细胞的 不利因素影响。为角质形成细胞培养的发展趋势。,2023/10/7,45,MCDB153无血清培养基 角质形成细胞培养基。适用于低密度接种的传代表皮细胞的生长,但 原代培养时细胞克隆形成率较低,不能满足较高 密度细胞生长的需要。细胞以单层方式向外生长,但细胞之间缺乏桥粒 连接,不能形成表皮皮片。培养液中的牛脑垂体提取物或猪脑垂体提取物 价格昂贵，疯牛病的危险。,2023/10/7,46,角质形成细胞无血清培养基(DKSFM,Gibco)去除牛脑垂体提取物。保留对角质形成细胞的促生长作用,同时抑制成纤维细胞生长。角质形成细胞贴壁快,增殖迅速,细胞长满单层后,呈现出典型的铺路石状,细胞呈多角形。细胞免疫组化染色抗角蛋白抗体染色阳性。整个培养周期中,角质细胞呈现出基底细胞形状,细胞表面没有分泌物。操作简便易行,安全适用,避免了以胶原或3T3细胞为滋养层法的缺点。,2023/10/7,47,影响角质形成细胞培养的因素皮肤标本的来源 正常人外科包皮环切手术弃之皮肤 标本运输和保存 无菌容器 短时间存放于平衡盐溶液,长时间存放于营 养液中。标本预处理 清洗、去除组织、剪切,2023/10/7,48,表皮和真皮的分离 胰蛋白酶 分离基底细胞和上面的细胞。既破坏桥粒又破坏半桥粒结构。消化时间过长,丢失部分基底细胞。消化时间过短,表皮和真皮分离不完全,混有 成纤维细胞。,2023/10/7,49,中性蛋白酶 主要分解IV型胶原和纤维粘连蛋白。作用于表皮和真皮的结合处。只破坏半桥粒结构。获得的角质形成细胞活力较高,增殖迅速,融 合成片的速度快。减少成纤维细胞污染。可获得含有完整基底层细胞的表皮。Dispase(GIBCO)中性蛋白酶分离表皮和真皮,再用胰蛋白酶消化表皮成为单个的细胞。,2023/10/7,50,培养液中主要的添加物 胰岛素 氢化可的松 三碘甲状腺原氨酸 霍乱毒素 转铁蛋白 表皮生长因子,2023/10/7,51,主要添加物的作用 促进细胞的葡萄糖和氨基酸的吸收。促进细胞的粘附和增殖。促进细胞的合成代谢。提高细胞内第二信使cAMP水平。降低铁离子对细胞的毒性。促进角质形成细胞的有丝分裂。,2023/10/7,52,钙离子浓度 与表皮细胞体外培养的多层化有关,钙离子 浓度低至一定浓度时,细胞的分层现象消失。低钙(0.050.15mM)时角质形成细胞不分化,细胞增殖最佳;当钙离子浓度上升到1.0mM时,角质形成细胞发生分化,显示生长。,2023/10/7,53,角质形成细胞株(系)应用 COLO-16株 来自于鳞状上皮癌的人角质形成细胞。HaCaT株 永生化的正常人皮肤角质形成细胞(140 代)。,2023/10/7,54,三.细胞培养技术在皮肤病相关领域中的应用,2023/10/7,55,微载体培养 细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。特点 不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下 提高培养表面积。省却了容器等的清洗和准备工作。细胞与培养液的分离简单。减少繁复的操作步骤,降低污染率。提高产率。微载体制作材料的进展 葡聚糖 纤维素 聚乙烯和二氧化硅,聚苯乙烯 明胶,2023/10/7,56,在化妆品功效研究中的应用,传统皮肤细胞培养方法的应用 单层的培养技术-皮肤组织获取和化妆品研发 培养黑素细胞-美白化妆品活性成分筛选 朗格罕细胞、和淋巴细胞共同培养-体外筛选化妆品过敏作用 富含Merkel细胞的表皮细胞悬液培养-局部应用药物的耐受机制研究,2023/10/7,57,成纤维细胞的培养-抗衰老化妆品活性成分开发中应用(筛选中 草药有效成分的抗衰老活性)-化妆品生理功效研究中应用,2023/10/7,58,皮肤细胞的“三维培养”器官型培养(气-液体交界面培养)分离、培养皮肤的,使其在体外扩增,然后将其接种于真皮类似物上,暴露于空气中,使表皮正常分化,形成类似天然表皮的复层组织(体外重建表皮)。真皮类似物 去表皮真皮 胶原基质 惰性材料 应用 真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮 的简化的人皮肤。用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的 生物学效应,了解表、真皮之间的相互作用。将其他细胞(内皮细胞、白细胞)引入真皮类似层,扩大测试系统 的使用范围。,2023/10/7,59,皮肤器官培养 活体皮肤于体外培养，并使其保持其一定的结构和功能。培养方法 液体浸没的皮肤器官培养 气-液面交界的皮肤器官培养 应用 化妆品对皮肤急性刺激毒性研究,2023/10/7,60,在化妆品研发中的应用 延缓皮肤衰老化妆品 以皮肤和成纤维细胞为受试对象,寻找或筛 选具有抗衰老活性物质,确定该物质基本毒性情 况。(观察对两种细胞增殖能力及活性的影响)研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用。(如、药物及化妆品等)将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究,2023/10/7,61,皮肤美白产品 将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。光生物学研究,如防晒剂的效果评价。,2023/10/7,62,化妆品配方及成品的毒理学研究 单层皮肤细胞培养 外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏 反应。皮肤三维培养 化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部 应用化合物(药用化妆品、表面活性剂、渗 透剂和杀菌剂等)效果评价。,2023/10/7,63,毛发用化妆品 以毛根鞘上皮细胞为对象,进行护发活性物质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究。,2023/10/7,64,基础研究 皮肤三维培养(重建表皮、真皮类似物)-化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性 研究-重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研 究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应 机制；化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功 能的保护作用-真皮类似物用来研究真皮层的组成及生理 功能-重建表皮+真皮类似物共培养系统用来研究 皮肤生理代谢、化合物的光毒性、效 应和防晒剂的作用,2023/10/7,65,体外细胞培养模型 角质形成细胞 黑色素细胞 朗罕氏细胞 成纤维细胞 皮脂细胞,2023/10/7,66,细胞培养评估方法及指标 评估目的 细胞模型 评估指标 毒性 2,3-细胞培养 细胞形态,细胞活性(中性红MTT,LDH,PEG2)美白 黑素细胞培养 黑素的生成 黑素细胞和 酪氨到酶活性 角朊细胞共培养 3-细胞培养 抗衰老 成纤维细胞培养 细胞增殖,胶原蛋白,角朊细胞培养 弹性蛋白,3-细胞培养 粘多糖等的生成,2023/10/7,67,在基因工程药物血药浓度测定中的应用,特定依赖细胞株培养法 以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细 胞数目的增减为量效指标。细胞增殖法:促进特定依赖细胞株增殖,抑制增殖法:抑制细胞增殖,2023/10/7,68,细胞培养量效指标的测定方法 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-TdR)59Fe核素标记法 四氮唑盐法(MTT)直接计数法 其他间接法,2023/10/7,69,细胞毒性的观察方法 放射性同位素摄入法 3H-胸腺嘧啶-3H-亮氨酸-培养基中掺入3H-亮氨酸，根据 3H-亮 氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合 成情况。同位素法特点 揭示细胞分子水平的动态变化,是研究细胞代谢 状态的重要手段。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法),2023/10/7,70,荧光染色法 乙酰乙酸荧光素法 当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性 屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化 乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在 荧光显微镜下迅速区分受损细胞。,2023/10/7,71,发光细胞活力测试 采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力 细胞。荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底 物，产生氧化荧光 素，并以光的形式释放能量。由 于荧光素酶反应需要ATP，因而反应产生光的总量 和反映有活力细胞数的ATP总量呈正比。产生的发 光信号和培养基中的有活力细胞数呈正比。特点 适用于高通量应用，测试大批量样品可快速得到 结果。需要特殊的发光仪或CCD相机读取发光信号。,2023/10/7,72,流式细胞光度术(FCM 法)利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单 列,按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光,检测 器可逐个对细胞的荧光强度进行测定。特点 对细胞测定能力为30-60万个细胞/分钟,同时可对细 胞的核酸,蛋白质酶、细胞周期分布等八种参数进行 测定。,2023/10/7,73,在药物开发中的应用,药物筛选模型 整体动物水平 组织器官水平 细胞分子水平细胞分子水平药物筛选模型 细胞系的生物学特征较为一致，用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，判断药物疗效及其毒性。材料用量少，药物作用机制较明确，实现大规模筛选，缩短新药筛选周期。,2023/10/7,74,模型优势 大样本量的筛选(扩大筛选对象和范围)。一药多筛(样品量少，珍贵药物多模型筛选，扩大新药范围)。高通量药物筛选(HTS)计算机控制的自动化大规模筛选体系。利用细胞培养制出的新药 基因工程药物 细胞工程药物,2023/10/7,75,细胞培养中的药物试验问题 细胞的选择 敏感株 原代 细胞 性别系(株)药物的溶解和保存 溶剂的选择 药物剂量 半效剂量(ID50)选择合适指标粗略估算法 借用药物LD50精确计算 药物作用时间 接种后约第48小时(指数生长期)时-效曲线,2023/10/7,76,思考题 1.应用细胞培养技术进行实验研究中细胞 生长、活力及细胞毒的测定方法 2.角质形成细胞体外生长特点,2023/10/7,77,谢 谢！,2023/10/7,78,
