核酸的分离与检测.ppt

Chapter 3 Separate and investigate target gene,Wellcome to Genetic Engineering By Nieguangjun,从哪儿提取（Where）？怎么提取（How）？提到什么程度（What）？会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？,核酸提取的原则和基本要求核酸提取的一般过程关键试剂的作用核酸的部分特征核酸提取的常用方法核酸提取经典案例核酸提取的注意事项核酸提取出现的问题及对策核酸提取的相关说明,主要内容,核酸提取的原则和基本要求,Principle and steps,Principle 保持核酸的完整性；提高核酸的质量（纯度和浓度）。Requirements for purification不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他事物大分子（Pr、sugar and lipid）其他核酸污染,核酸提取的一般过程,Principle and steps,Steps样品准备（取材）破细胞（物理法、化学法、酶法）；除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；沉淀提纯,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,破碎细胞-方法,机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS或CTAB处理细胞；酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,破碎细胞-来源,动物：小牛胸腺动物肝脏、血液和肌肉组织等鱼类精子；植物：种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物：谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%（培养过夜）。,Note：从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从高等动植物中提取DNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。,破碎细胞（来源-方法）,微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,抽提核酸除去杂质,1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2使核酸与蛋白质分离3除去脂类 4多糖的除去,How to remove？,核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,How to do？,核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4（5）最佳和最简单-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,关键试剂的作用,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,关键试剂的作用,核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,核酸的部分特征,核酸的部分特征,存在形式pH值影响盐影响温度影响,1.存在形式,RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。,removal of Pr,2.pH值的影响,DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在pH值高达12.6的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA完全复性，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,碱变性法（for plasmid DNA）,3.盐影响,DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,浓盐法,4.温度影响,高温变性低温复性,沸水浴法（for plasmid DNA）,核酸的常用提取方法,常用的DNA提取方法,浓盐法阴离子去污剂法苯酚抽提法水抽提法沸水浴法碱变性法,1.浓盐法,原理：利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；常用的方法：用1M 氯化钠提取氯化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来（也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白）。,1.浓盐法,注意以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用0.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.,2.阴离子去污剂法,用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.,3.苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。,4.水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液；在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出；然后分别用66%80%和95%乙醇以及丙酮洗涤；最后在空气中干燥,既得DNA样品。,此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。,5.沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）,1.在Eppendorf管中加入110 ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml）（蔗糖8，Triton X-1005，Tris-HCl(pH8.0)50 mM，EDTA(pH8.0)50 mM）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。2.上述菌体悬浮液沸水煮30秒。3.迅速放置于常温下15000 rpm离心15分钟。,5.沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）,4.用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml的异丙醇，充分混匀后4，15000 rpm离心20分钟。5.弃上清液，加入70%冰乙醇400 ml，4，15000 rpm离心5分钟。6.沉淀凉干后用50 ml无菌重蒸水溶解。7.取5 ml电泳检测。,6.碱变性法,原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在高pH值条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；当pH值调至至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,核酸提取的经典案例,主要案例,碱变性法制备大肠杆菌质粒DNA 大肠杆菌染色体DNA的抽提 CTAB法提取植物基因组DNA,6.碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）,1.1.5 ml培养物6000 rpm，4离心10分钟，弃去上清液。2.加入100 ml溶液I悬浮菌体，室温放置5分钟。3.加入200 ml溶液II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。4.加入150 ml溶液III，轻轻混匀，冰浴30分钟。5.4，15000 rpm离心20分钟，收集上清液。6.上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400 ml）氯仿，充分混匀，4，15000 rpm离心20分钟，将上清液转移至另一离心管。,6.碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）,7.在上清液中加入400 ml氯仿溶液，混匀，10000 rpm离心10分钟，将上清液转移至另一离心管。8.在上清液中加入400 ml异丙醇，20放置30分钟，4，15000 rpm离心20分钟。9.用400 ml 75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。10.加入50 ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。11.取2 ml作酶切电泳检查。,6.碱变性法-试剂,溶液I：D-Glucose 50 mmol/L，Tris-Hcl（pH 8.0）50mmol/L，EDTA（pH 8.0）10mmol/L121消毒20分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为 5mg/ml 溶液II：SDS1%NaOH0.2 mol/L溶液III：KAc（pH5.5）3 mol/L,溶液-溶菌液,1溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境）葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。,溶液-溶菌液,2.EDTA的作用：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,溶液-NaOH-SDS液,NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性.,溶液-NaOH-SDS液,SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。,溶液-3MOL/LNaAc(pH4.8)溶液,NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了将pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3Mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。,大肠杆菌染色体DNA的抽提,大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4，离心10分钟收获菌体沉淀。沉淀中加入3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37保温30分钟。加入400 ml 10%SDS使最终浓度为1%，混匀，37保温30分钟或澄清即可。加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60保温60分钟。加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。4，15 000 rpm，离心30min。,大肠杆菌染色体DNA的抽提,取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4，15000 rpm，离心30分钟。取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4，离心10分钟。取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后-20放置30分钟以上，4，15000 rpm，离心30分钟。弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4，15000 rpm，离心5分钟。弃上清，沉淀于37凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。取5 ml电泳。,CTAB法提取植物基因组DNA,CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。,实验程序,1.在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20 l-巯基乙醇,65预热。2嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。,实验程序,3加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。4向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置3720-30min。5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 min或-80放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。6 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。,核酸提取的注意事项,注意事项,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,注意事项（细胞破碎）,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,注意事项（分离与纯化）,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,注意事项（沉淀、溶解）,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,核酸提取的常见问题与对策,常见问题与对策,问题与对策,问题与对策,核酸提取的相关说明,为什么用无水乙醇沉淀DNA?在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL?加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc来处理?为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?,为什么用无水乙醇沉淀DNA?,乙醇的优点：可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。原理：DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。,在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么要加NaAC或NaCL,在pH为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.,加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?,加进去的Rnase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好的效果。,为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？,在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.,如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?,采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%.选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.,抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?,苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中）经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。（利用氯仿除酚）,为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?,在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比。也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成,)，同时异戌醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?,因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定.在中性或碱性条件下(pH5-7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用。,1.传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱分离mRNA,2.把oligo(dT)-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA,3.用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA,三种分离mRNA的方法,用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图,Chapter 3-2 How to assay NA,Wellcome to Genetic Engineering By Nieguangjun,Methods,分光光度法二苯胺法定磷法电泳检测法,分光光度法,原理：构成核酸的嘌呤和嘧啶环的共轭双键系统使核酸在260nm波长处有最大吸收峰，其光密度值与单位体积核酸含量成正比。方法：核酸种类及其存在状态不同，其光密度值与核酸含量的比值有异，浓度计算：1 OD 260相当于dsDNA 50g/mL，ssDNA33g/mL和ssRNA 40g/mL。纯度计算：从OD260：OD280的值可定性DNA 并了解核酸的纯度，纯的DNA(RNA)制品的比值为1.8(2)。,二苯胺法测定DNA含量,DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成-羟基-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40g-400g范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,定磷法测定DNA,核酸经浓硫酸或高氯酸高温水解后，释放出无机磷。在酸性条件下，磷酸与钼酸铵结合，生成磷钼酸铵黄色沉淀：PO43-+3NH4+12MoO4+24H+=（NH4）3PO412MoO36H2O+6H2O,在过量（NH4）212MoO4存在时，黄色沉淀溶解于过量的磷钼酸盐溶液中。当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再与试剂中其他的MoO42-结合成Mo（MoO4）2或Mo3O8，呈蓝色。该产物在660nm处有最大的光密度峰，其峰值与光密度成正比。求得单位体积的含磷量除以9.0%既可得单位体积RNA的量，或除以9.2%则为DNA的含量（测DNA时）。核酸制品中微量的无机磷，非核酸的有机磷、硅酸盐、铁离子以及酸度过高或偏低都会影响定磷法的测定结果；但其灵敏度高，最低可测到核酸10g/ml的水平，准确性较好。,定磷法测定DNA,电泳检测法,原理：琼脂糖是一种直链多糖。它是由BD 吡喃半乳糖和3，6脱水半乳糖以1，3糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基因工程上首选的凝胶剂。当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0 条件下带负电荷，在电场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。,迁移率与下列因素有关：,电泳检测法,电泳检测法,1.核酸分子的大小：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状双链DNA 分子的分子量对数成反比（图31）；所以根据迁移率大小可测定DNA 分子的大小。不过实际应用时，通常将待测定的DNA 和已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可知该样品的分子量大小。2、迁移率与核酸构象有关,琼脂糖凝胶电泳可以鉴别分子量相同但构型不同的DNA 分子。在依常规方法抽提的质粒DNA 通常具有三种不同的构象:超螺旋型（SC）、线形（L）和开环型（OC）。这三种构型分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋型（SC）迁移速度最快，其次为线状（L）分子,最慢的为开环型（OC）分子。若提取到的质粒DNA 样品中,还有染色体DNA或RNA,在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度(图32)。,凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5TBE,0.5ug/ml 溴化乙锭电泳条件1v/cm 16小时）,提纯和未提纯质粒DNA电泳图,迁移率与电泳条件的关系,低电压时，线状DNA片段的迁移速度与电压成正比，当电压高时，大分子量DNA片段的迁移速度就不再与电压成正比，所以电压一般不超过每厘米5伏。电泳液采用缓冲液，以保证较稳定的pH 值。pH 值的剧烈变化会影响DNA 分子所带的电荷，因而影响正常的电泳速度。电泳温度一般不影响电泳，但若因电压过高，引起发热将会导致胶融解。所以可采用冷却循环系统。,迁移率与琼脂糖浓度的关系,浓度越大，迁移率越低，当样品的分子量较大时，宜用较稀的琼脂糖浓度，分子量小时，浓度可选用大些，通常可选用0.7%浓度的凝胶。此浓度下分离DNA分子的范围为0.810 Kb。当核酸样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入在紫外线照射下能发射荧光的溴化乙锭（EB），EB就插入DNA分子中，形成荧光络合物，使其发射荧光增强几十倍，这样极其微量的DNA也可观察到。例如用肉眼观察，可检测到0.05ug0.1ug的DNA。,迁移率与琼脂糖浓度的关系,材料,1、DNA样品样品A：DNA（限制性核酸内切酶EcoRI，HindIII酶切后样品）样品B：染色体DNA+RNA样品C：质粒DNA（三种构型DNA）2、电泳缓冲液：Tris乙酸0.04mol/L PH8.00.002mol/L EDTA3、加样缓冲液：0.25%溴酚兰40%w/v蔗糖4、溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水5、琼脂糖6、水平式微型电泳槽；电泳仪；微量取样器，玻片等。,缓冲溶液配制表,实验步骤,1、用胶纸带把电泳槽两端封好，以免凝胶溶液漏出，将电泳槽置于平面水平。2、选择孔径适宜的点样板（梳板）。将梳板置于距凝胶槽一端一厘米并与该端平行的位置。梳板垂直架在槽上，使梳板底部不要触到槽底部，大约相距1 毫米左右。3、称取琼脂糖0.3 克置三角瓶中，加入40 毫升电泳缓冲液，于电炉上加热，至琼脂糖完全融化，取少量凝胶溶液沿胶带纸边缘封好，防止倒凝胶板时出现渗漏。4、在凝胶溶液中加入0.4 毫升溴化乙锭溶液（EB 最终浓度为0.5ug/ml）摇匀，待凝胶溶液冷却至55（手摸烧瓶不烫手）轻轻地倒入水平微型电泳槽内。除掉气泡，或用梳板将气泡排至凝胶边缘。5、室温下，凝胶放置30 分钟，待其凝固后，拔去梳板，保持电样孔完好。除掉防渗漏的胶带纸。把制备好的装凝胶块的微型电泳槽，放入水平大电泳槽，点样孔一端应在大电泳槽电极负极一端。然后在水平大电泳槽内加入电泳缓冲液，使其液面高于凝胶1 毫米左右。,实验步骤,6、按以下混合好样品（以下为参考值，可视实际样品作调节）。2 微升样品A，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。2 微升样品B，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。2 微升样品C，2微升加样缓冲液，10 微升电泳缓冲液。7、在玻片上各把上述样品混合均匀，用微量取液器分别吸取样品，小心将样品注入点样孔内，记录样品的点样顺序。8、点样孔那端的电泳槽负极连接电泳仪负极，另一端连接电泳仪正极，打开电泳仪电源开关（每次打开电源开关时，应检查电压旋扭是否置于零位），调电压至5v/cm（以水平大电泳槽的两极算距离）。9、待溴酚兰带走入凝胶6 厘米后，小心取出微型电泳槽，勿使凝胶滑出，置于保鲜纸上，放在紫外检测仪上，打开紫外灯，观察电泳结果，绘好DNA区带电泳图。,【注意事项】,1.溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。2.紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。,基因工程：第三章,Questions,核酸提取的原则和要求？核酸提取的一般步骤？核酸提取的常用方法有哪些？核酸提取过程中SDS、CTAB、EDTA有何作用？核酸提取过程中乙醇（无水和70%）有何作用？如何除蛋白？如何破细胞？在破细胞时需要注意哪些事项？如何防止内源性核酸酶对核酸的损失？检测核酸浓度和纯度的方法有哪些？基本原理？,基因工程：第三章,GAME IS OVER.,