应用微生物学1、2.ppt

应用微生物学,教学计划及参考书,本课程30学时2学分（每周两学时）无教材参考书：1、姜成林等编 微生物资源开发利用2001.42、岑沛霖等编 工业微生物学 2000.63、杨柳燕等编 环境微生物技术2003.84、李虞庚 冯世功 编译石油微生物学1991.55、徐积恩 朱明珍编抗 生 素1982.86、柳忠辉 吕昌龙主编免疫学常用实验技术2002.8,绪论,第一节 应用(经济)微生物学的诞生与发 展第二节 应用微生物资源第三节 应用微生物资源的发掘、驯化 和应用,第一节 应用（经济）微生物学 的诞生与发 展,一、概念：（一）、应用（经济）微生物：是指在国民经济中得到广泛应用并能产生显著 经济效益的微生物。主要包括两大部分：、当前有使用价值、能制造出较高经济效益的微生物。、具有较高开发潜力的微生物。,（二）、应用微生物学：是对应用微生物的基础理论、应用技术、微生物产品及制品的生产、应用等一系列问题进行研究的科学。二、诞生与发展（一）感性认识阶段 微生物学已有300多年历史，在微生物学的史前阶段，人们对微生物只有感性认识。,（二）理性认识阶段 随着光学显微镜，特别是电子显微镜的发明，对微生物的认识已上升到理性认识阶段。随着微生物生理学、微生物生物化学和分子生物学及分子遗传学的发展，对微生物的认识也不断地深化，使有害微生物得到有效控制，有益微生物得到充分利用，逐步形成了“经济微生物”的概念。,特别是采用生物工程新技术以后，经济微生物资源进一步得到充分利用，为社会创造出的物质财富也更加丰厚，这就是目前国内外在应用科技上重点开发经济微生物的原因。,三、应用微生物学涉及的领域,微生物学的迅速发展及应用，导致经济微生物在国民经济发展中发挥了巨大的作用，因而产生了经济（应用）微生物学。,近年来，国外以经济微生物学为内容的书连续出版了8卷(卷1：酒精饮料；卷2：初级代谢产物；卷3：次生代谢产物；卷4：微生物生物量；卷5：微生物酶和生物转换；卷6：微生物腐蚀；卷7一卷8：食品微生物学)。由此可见这是一个新兴的科学领域，涉及的面十分广泛，发展极其迅速，世界各国都非常重视。,随着我国国民经济和生物工程的发展，必将更迅猛地推动经济微生物学的研究和发展，会有更多的人认识到它的重要性。随着分支学科工业微生物学、食品微生物学、农业微生物学和医学微生物学等学科的发展。也必将推动经济微生物学的更快发展。,（一）应用（经济）微生物学涉及的领域主要有：医药、食品工业、农业、化工原料、环保、冶金、采油等领域。并在以上各领域中得到了广泛应用,且给人们带来了巨大的经济利益。,第二节 应用（经济）微生物资源,微生物是人类赖以生存的重要资源之一，在食品、医药、化工等许多领域得到了广泛应用，而且发挥着巨大的作用。,自古以来，我国人民就知道利用曲酿酒、酿造调味品；面醪可制作面食（馒头、面包）；酸性矿水能浸出铜矿；沤肥能提高速效养分；豆科植物的根瘤能肥田；疯狗脑可防治狂犬病；“人痘可防天花、等等。这些都是利用经济微生物造福于人类的例证。,一、应用（经济）微生物的种类：主要包括细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群。自然界中微生物资源是非常丰富的，但迄今为止，已经发现的微生物仅占总数的10左右，在工、农、医诸方面被利用已获得经济效益的微生物则更少，只有数百种。,因此，研究和开发经济微生物资源的任务非常艰巨，但潜力很大，前景广阔。利用高新科学技术发掘新的微生物资源，改造老的微生物资源，必将对经济微生物学的发展起着明显的推动效应。,二、经济微生物在工、农、医的应用：应用非常广泛，有的是直接利用菌体(如酵母片、菌体蛋白、活性干酵母、微生物农药、微生物肥料和食用菌等)；有的则是利用其代谢产物(如乙醇、柠檬酸、氨基酸和抗生素等)和分泌的酶类(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和果胶酶等)。,（一）、细菌的应用,细菌资源可供生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇和发酵食品；可用于氨基酸、有机酸、糖类、核甘酸、维生素和抗生素的发酵；还可用于甾体物质转化，生物农药及肥料的生产以及湿法冶金、采油等。,（二）、放线菌的应用,放线菌的资源主要用于生产抗生素在已发现的1000多种抗生素中，由放线菌产生的占23。此外，在氨基酸、核甘酸和酶制剂的生产以及甾体物质的转化等方面放线菌也有重要的作用。,（三）、酵母菌的应用,酵母的资源利用从本世纪50年代后期开始，已由酒精发酵力强的发酵型酵母转向发酵力弱或无发酵力的氧化型酵母。如：食用、药用和饲料酵母，以及生产多元醇、油脂、有机酸、维生素和酶制剂的酵母等。,（四）、霉菌的应用,霉菌的资源主要用于酶制剂、抗生素、有机酸、氨基酸和核酸等的生产。近几年国外又开始兴起利用霉菌生产油脂，如最近日本工业技术院化学技术研究所分离到一种被孢霉产油酯的能力比以往菌种高7倍，他们已设计出年产油脂7000t的成套工艺设备。发酵罐容积为1000t。,（五）、担子菌的资源利用,担子菌的资源利用正愈来愈引起人们的重视。如多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。近来日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入研究，发现有一种“1，3一葡萄糖甘酶”具有抗癌作用。且香菇含有的多糖类物质 也具有抗癌作用。,我国把猴头的菌丝体制成片剂在临床上用于治疗胃癌、贲门癌和食道癌，有效率达69.3，若再配伍其他中草药有效率可提高到82.8。,（六）、其他微生物资源应用,可利用蓝细菌生产蛋白质(如螺旋蓝细菌的菌体蛋白质可达70)、脂肪以及处理废水获得能源；利用原生动物监测活性污泥的质量和工业废水中的有毒物质等等。,第三节 经济微生物资源的发掘、驯化和应用,要想获得有价值的经济微生物种类，必须从自然界中发掘出来、经过驯化再应用到生产上。,一、应用（经济）微生物的发掘,微生物资源开发利用 的程序通常由：总体设计、找到目的菌、效果试验、申请专利、菌种改良及发酵工艺研究、报批、生产、市场等相互关联的过程所组成。现就部分要点作一般介绍。,(一)、总体设计,总体设计是微生物资源开发利用的首要任务。1、市场是核心。包括现有市场、潜在市场、竞争对手、自己的市场开拓能力、开发的策略、工作基础、已具备的条件、自己的优势和劣势、合作伙伴的力量及诚信度、投资大小、投资周期及风险等。,2.创新是灵魂 一套好的总体设计往往要有几套方案，根据情况变化而随机应变。避免开发目标与别人相重，保证能及时改变战略，力争别处领先。,(二)、找到目的菌,1.菌种来源：可来自两方面。一是来自菌种保藏中心：目前至少有 58个国家共建立了 484个菌种保藏中心，已保藏菌种80多万株，很多是典型菌株。,二是自己分离菌种：就是要根据开发目标:选择取样地域、取样环境。如：土壤 海洋 极端环境。未知微生物是最值得开发的资源。,2.模型设计（1）筛选模型的概念：筛选模型是用于证明某种物质具有生物活性、的实验方法，这些实验方法是寻找和发现新物质，新菌种的重要条件之一。,（2）筛选模型的标准：准确、微量、快速、简便（3）模型设计：可根据 作用机制、代谢途径的靶位、酶反应机制、基因操作过程的各种调控因子、目的化合物的类型等来设计。模型设计是微生物开发最活跃的领域。,3.一菌多筛 不仅有利于找到目的菌、增加了菌种的利用率和入选率，更重要的是有可能找到用途更大的非目的菌，（比如具有某种活性的菌）。这就需要开发人员：全局在胸、看的深远、通晓相关领域的动态。同时还需要制定几套筛选方案。,4.高通量筛选和组合生化相结合 高通量筛选：是将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样、培养后，用计算机记录结果，并进行分析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现了快速、准确、微量，一周可筛选成千上万个样品。,组合生化：是用已知有用化合物或已知骨架的化合物分别与不同的微生物共培养，然后分析不同培养时间化合物的结构及其活性 的变化（发生修饰或转化），从而极大地增加了化合物的多样性，相应增加了获得理想化合物的可能性。,若把组合生化与高通量筛选结合起来，筛选的效能将大大提高，找到优越化合物的可能性剧增。,（三）、申请专利,1.申请专利的时机：一般应在确定某种新活性、新用途、或新化合物时立即申请。新菌种也可申请专利，不同国家有不同规定：美国：新菌种发表后就不能再申请专利。西欧国家：发表一年内可以申请专利。所以在新菌种被接受可以发表时（到发表还有约三个月到半年时间）立即申请专利最为合适。,2.什么情况下不必申请专利？如果别人仿制了你的技术，而你又无法弄到明确的证据，那么你就要靠保密手段来保护知识产权。3.聘请法律顾问或专利申请代理人。,（四）、菌种改良和基因工程,1.传统的理化诱变技术 是目前普遍采用的方法，使菌种发生突变，存优去劣，容易施行、易见成效。2.基因工程技术 是研究目的物的基因结构及基因调控、表达的方式，进行基因重组、转殖，使之高效表达。本技术将变成常规技术，成为微生物资源开发利用的强大武器。,（五）、微生物资源开发利用的重大课题,1.微生物资源种类的探索：未知微生物的分离是微生物资源开发利用的重要前提和基础。2.生物固氮 尤其是非豆科粮食作物的固氮是最值得研究的重大课题。3.微生物药物的开发 仍然是当今的重大任务。,随着开发进程的不断深入，开发领域的不断扩大，新技术的发展和渗透，微生物资源开发利用将会日新月异，新思维、新产品、新用途、新领域将层出不穷。使微生物资源将更好的为人类造福。,二、经济微生物的应用,发掘、驯化的微生物只有经过生产实践的检验才能证实它是否具有经济效益，也只有通过在生产上应用才能发挥它的经济价值。若要使经济微生物实现应用，必须使之成为微生物产品。微生物产品的生产如下图所示。,菌种源,接种,培养基,培养,分离,培养液,死细胞生物量,细胞,死细胞破碎,膜分离澄清,离心,离心,离心,产品稳定,产品稳定,产品稳定,脱水,脱水,脱水,干产品,新鲜产品,干产品,新鲜产品,干产品,新鲜产品,贮存、使用,第一章 药用微生物的开发及应用,微生物在自然界中几乎是无处不有,无处不在.并且种类多,繁殖快,因此,它们具有产生各种各样具有不寻常化学结构和不寻常生物学活性化合物的无限潜力,这些化合物在医药上的应用是微生物资源开发应用的一个重要方面。自古以来,微生物药物就用于防病治病,特别是近一百多年来,经过几代人的努力,这类药物通过工业化生产大量投放市场,对于保障人类健康起到了不可估量的作用。,本章主要介绍以下几方面的内容：第一节、药用微生物资源开发利用的历史第二节、药用微生物的来源和分离方法第三节、微生物药物的研究与开发第四节、微生物药物的生产,第一节药用微生物资源开发利用的历史,一.微生物之间的拮抗现象二.第一个实用抗生素青霉素的发现三.链霉素的发现与新抗生素开发的活跃期四.半合成抗菌素的发展五.微生物药物应用范围的扩大六.药用微生物发展的趋势,一、微生物之间的拮抗现象,一种微生物的生长如果造成对周围其他微生物生长的抑制,这种现象就叫做拮抗现象。也可以说:一种微生物在生命活动过程中,通过其产生的某种代谢产物或改变环境条件,能够抑制别种微生物的生长繁殖,或毒害甚至使别种微生物致死的现象。,在医学上用抗生素治疗感染等疾病,就是依据微生物之间的拮抗现象进行的，那么,这种现象是谁在什么时间发现的呢？（一）拮抗现象的发现1、世界上最早报告的拮抗现象 1874年,W.Roberts发现某种霉菌能抑制细菌的生长。是世界上最早报告的拮抗现象,2、巴斯德（1822-1895）指出可利用拮抗现象治疗感染症 1877年,巴斯德发现炭疽杆菌培养物被杂菌污染后其对人体的感染力下降,并指出可利用拮抗现象治疗感染症。,3、拮抗现象的本质的揭示 1887年,进一步发现：绿脓假单胞菌产生的水溶性物质能够抑制包括葡萄球菌在内的各种细菌的生长，从而揭示了拮抗现象的本质。,4、拮抗作用物质的获得 1889年：从一种细菌的培养液中提取得到对炭疽杆菌有拮抗作用的物质；还由一种青霉的培养液中分离精制得到后来被命名为:霉酚酸的抗菌活性物质。,5、世界上首次利用拮抗现象治疗感染症的实例。1899年，O.low报告局部应用假单胞菌的培养液治愈了皮肤感染症，这是世界上首次利用拮抗现象治疗感染症的实例。从以上可以看出,拮抗现象的发现是漫长的,自1874年-1899年25年的时间,经过十几位科学家的艰苦努力对这一现象才有了初步的认识,但没有真正得到抗生素。,二、第一个使用抗生素-青霉素的发现,1.青霉素的第一次发现:1928年,英国学者Fleming(1881-1955),在研究葡萄球菌的变异时,发现一个培养皿在污染了霉菌(后来被确认为点青霉)的菌落周围出现了无葡萄球菌生长的透明抑菌圈.Fleming用这一霉菌的培养滤液进行了动物抗感染试验,获得了确切的疗效,而未见对宿主兔子的白血球产生影响.他把存在于点青霉培养滤液中产生这一抗菌作用的有效物质叫做青霉素(Penicilin).,但由于点青霉产生青霉素的能力很弱,当时未能将这一物质分离出来（只知道在酸性条件下可将其萃取到脂类溶剂中）,加上那时抗菌磺胺药物的应用正处于十分盛行的时代,因而这一发现长期未能得到人们的重视。,2.青霉素的第二次发现 在Fleming 首次发现青霉素10年后，1938年,英国牛津大学的生理学家 开始了对微生物产生的抗菌物质进行系统的研究.在等化学家的协助下,于1940年成功的获得了较为纯净的青霉素,用于对葡萄球菌和链球菌感染的实验动物进行治疗,产生了意想不到的效果.其有效剂量低于当时的任何抗感染药物,而未出现任何副作用。这就是后人所说的对青霉素的第二次发现。,由于当时英国正处于第二次世界大战的前沿,缺乏青霉素产业化的环境,故将这一研究工作移到了美国。在美国国家的支持下,以制药公司为中心的青霉素研究取得了很大进展。,筛选获得了被称为产黄青霉的高产菌株;并且改良了培养方法(由固体发酵改成了液体深层发酵,）从而很快开始了大规模工业化生产.1941年,青霉素开始用于救治二战的伤病员,进一步证明了它的无以伦比的疗效,被当时的人们誉为黄色的魔物,主要是因为当时的提取纯度不是很高,使产品带有产生菌的黄色色素.,由于青霉素这一划时代抗生素的发现,Fleming,Florey和Chain同时获得1945年诺贝尔医学生理学奖。在这一研究中开发的大规模通气,搅拌培养方法也为后来各种抗生素和其他发酵产品的工业化生产打下坚实的基础。,三.链霉素的发现与新抗生素开发的活跃期,1939-1941年,几乎与第二次青霉素发现的同时,抗细菌的抗生素:短杆菌肽和短杆菌酪肽先后被从土壤革兰氏阳性杆菌培养液中分离得到;并且还从灰黄青霉培养液中获得了抗真菌的抗生素-灰黄霉素.,于是,美国著名土壤学家瓦克斯曼(SlemanA.Waksman)(1888-1973)对以上抗生素的研究工作表现了极大的兴趣,因此,他对土壤中一类新的微生物放线菌的拮抗特性进行了系统的研究,发现许多放线菌能产生抗生素.并于：1940年,发现了放线菌素 1942年,发现了链丝菌素,1943年,他又由鸡咽喉中分离得到了一株灰色链霉菌,从中分离得到了不仅抗革兰氏阳性细菌,而且抗革兰氏阴性细菌,特别是对结核杆菌有效的广谱抗生素链霉素.,大家都知道:青霉素只对革兰氏阳性细菌和少部分革兰氏阴性球菌有抗菌活性.由于当时结核病对人类的威胁很大,因而,链霉素的发现在社会上引起了很大反响。瓦克斯曼也因此获得了1952年的诺贝尔医学生理学奖.,青、链霉素的发现并使用化,极大的推动了抗生素研究的发展,各种新抗生素不断的被发现,使抗生素在抗感染治疗中发挥着日益重要的作用。针对青霉素对革兰氏阴性杆菌无活性；链霉素对链球菌和破伤风杆菌作用弱的缺点，在19471950年又先后开发了更具有广谱抗菌作用的:氯霉素(对肠伤寒有特效)金霉素、土霉素(对当时流行的斑疹伤寒及对耐磺胺药的痢疾杆菌引起的赤痢疗效显著).,但是，随着抗生素的广泛使用，开始出现对抗生素耐药的病原菌。于是,从19521957年又相继发现了：红霉素,白霉素(对青霉素耐药菌有效)卡那霉素(对链霉素耐药菌有效),并且,针对滥用广谱抗生素造成的真菌交叉感染(如:曲霉病和念珠菌病)开发了：制霉菌素和两性霉素B,等抗真菌抗生素 截止到1959年底，已发现的抗生素达1000多种,在临床上使用的约40余种。因此，这一时期被誉为抗生素研究的全盛期,抗感染化疗也进入了辉煌的抗生素时代.,四.半合成抗生素的发展,进入1960年以后,抗生素时代似乎从它的顶峰跌落下来,对抗生素大部分筛选工作都是重复过去已有的发现,寻找新抗生素变的越来越困难；已有的抗生素也由于日益增加的耐药性问题和不断显现的副作用(如：链霉素,卡那霉素的致聋;四环素使牙变黑四环素牙)问题而困扰着医药卫生界。,但是科学家们仍在不断地探索,不断地调整思路。用化学的方法对老抗生素进行改造，得到了很多疗效好，副作用小的半合成抗生素。,1.青霉素活性母核的发现：经过科学家的不断努力，1958年发现了：青霉素的活性母核-6-氨基青霉烷酸(6-APA)头孢菌素的活性母核-7-氨基头孢烯酸(7-ACA)以上两种活性母核可由青霉素和头孢菌素C裂解得到.,20世纪80年代以及近些年，由青霉素进行化学扩环分别获得了:7-氨基脱乙酰氧头孢烯酸(7-ADCA)氯甲基头孢苄酯(GCLE)两种母核。,用化学方法对这些母核重新装配不同的侧链,则获得了许许多多具有:扩大抗生谱、增强抗菌活力、改善药物代谢动力学、耐酸耐酶、抑制耐药菌等新特性的各种半合成青霉素和半合成头孢菌素，从而使抗生素时代再现出柳暗花明又一村的新局面。,目前，半合成青霉素和半合成头孢菌素的品种已不下于70个，产量和销售量均占据了抗生素的大半壁江山。2.新的含-内酰胺环抗生素的发现：1970-1980年，又先后发现了微生物产生的：,头霉素(7-甲氧基头孢菌素）、碳青霉烯、单环-内酰胺 等新的含-内酰胺环的抗生素，并相应开发出各种能够用于临床的半合成产品，使半合成-内酰胺抗生素家族进一步扩大。,3.其他半合成抗菌素的发展：在半合成-内酰胺抗生素取得巨大成功的鼓舞下：半合成卡那霉素、半合成四环素、半合成红霉素 等得到长足的发展，特别是半合成红霉素，因其药效和药动学的显著改善而更加引起世人注目。直到现在，用半合成方法改造已有的抗生素仍是开发临床上有效抗生素的重要途径。,五、微生物药物应用范围的扩大,1.微生物产生的抗肿瘤物质：嗜癌菌素、放线菌素D、肉瘤霉素、丝裂霉素、色霉素、道诺霉素、新制癌霉素、博来霉素、阿霉素 等 一个接一个的被发现，目前多数仍在临床上使用。人们把具有抗癌活性的微生物代谢产物也归为抗生素。,2.微生物产生的酶抑制剂：大家都知道：生物体内每时每刻都在进行的物质代谢（生物化学变化）均是在酶的催化下进行的。因此，酶的紊乱是引起各种非感染性疾病的重要原因。如：非淋巴细胞白血病、高胆固醇血症、糖尿病、高血脂、高血糖、肥胖等疾病。对人类健康的危害日益显得突出。,（1）.乌苯美司 是细胞表面氨肽酶B的抑制剂。因其具有免疫调节作用而用于某些 癌症如：非淋巴细胞性白血病的辅助治疗。（2）.洛伐他定、普伐他定、辛伐他定（半合成）是肝脏-羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂。,肝脏-羟基-甲基戊二酰可生成：甲羟戊酸是合成胆固醇的中间物质。因此以上三种微生物药物可用于治疗高胆固醇血症。（3）.阿卡糖、奥洛里糖、米格列醇是唾液腺和胰腺-葡萄糖苷酶的抑制剂。可用于治疗糖尿病。,（4）.奥里司他胰脂酶的抑制剂。可用于 减肥和控制高血脂、高血糖。3.免疫抑制剂的应用：如：抗真菌抗生素环孢菌素A在1970年被发 现和证明还有免疫抑制作 用。自80年代中期已成功 地应用于：防治器官移植 后的免疫排异反应。,后来又发现：藤霉素 雷帕霉素 也具有同样的免疫抑制作用，且活性较强、副作用较轻，引 起医学界的广泛瞩目。4.免疫激活剂的应用：（用于免疫力低下的人）,裂褶菌素、云芝多糖、香菇多糖、一些病原细菌的灭活细胞、破壁灵芝粉（液）等已在临床上用来进行抗癌、抗病毒的辅助治疗；或用于治疗慢性支气管炎及创伤性溃疡。上述（抗微生物和抗癌活性物质）以外的微生物药物，被称为微生物产生的药理活性物质，也叫作广义抗生素。,六、药用微生物研究开发的趋势,1、非抗生素类生物活性化合物的数量持续增加，使药用微生物的应用范围不断扩展。2、抗微生物活性化合物的作用靶由细菌扩大到其他微生物。(如：真菌、病毒、原虫以及微生物以外的生物如：寄生蠕虫、昆虫 等）。,3、被发现的药用微生物种类不断扩大。4、重组DNA技术的应用5、老抗生素及其半合成衍生物不断发现新的生物学活性、开发新的应用。,第二节、药用微生物的来源和分离方法,一、来源：二、具有医药品生产价值的微生物：三、药用微生物的分离：,一、来源,（一）土壤中的微生物（二）海洋中的微生物（三）热带地区的微生物（四）极端环境中的微生物（五）基因重组微生物,（一）、土壤中的微生物,1、土壤中各种微生物的数量：土壤是微生物资源的宝库。1g普通土壤中大约含有：1亿个细菌 1千万个放线菌孢子 1百万个真菌孢子,2、微生物在土壤中的一般分布规律：（1）含有机氮较多的中性及微碱性土壤中：细菌和放线菌占多数。（2）含有机氮少的酸性土壤中：真菌较多。（3）真菌多生活在土壤表层。（4）细菌放线菌可延伸到土层深处（1米）（5）近植物根系较多、远则较少。,（二）海洋中的微生物,1、海水的特点：（1）盐分含量高。（2）水温低。（3）有机质含量少。（4）海底承受的水压高。,2、海洋中微生物的特性：（1）嗜压（或耐压）（2）嗜盐（或耐盐）（3）低营养要求（4）可在低温下生长,3、海洋微生物的分布特点：（1）沿海岸比外海密度高（特别是江河入口及近海养殖场海域）（2）海面20-25米之上，微生物密度高，随 水深增加则密度下降，至海底淤泥又急剧升高。（3）砂砾海底数量偏低，1千米以上的海底中主要为嗜压细菌，其他微生物很少。（4）浅海水中的微生物对明胶、酪蛋白等蛋白质的分解力高于对淀粉的分解力。,（三）热带地区的微生物,1、热带地区的特点：（1）高温、高湿。（2）自然环境复杂、多变。2、热带地区微生物资源的数量 热带地区生存的生物极具多样性，也蕴藏着丰富的微生物资源。如：热带雨林只占地球面积的3.3，而生长着的生物种类却在50 以上。,所以，从热带雨林、热带深草原、热带沼泽等地的土壤、水流及动植物中分离药用微生物的前景是十分诱人的。,（四）极端环境中的微生物,高温、高压、高盐、高寒、强酸、强碱 等条件下生长的微生物，也有着重要的开发价值。不同的生境，生长着不同的微生 物。在特定的环境中可以找到特定的药用微生物。,（五）基因重组微生物,1、在生产生物活性蛋白方面应用：这类微生物首先在生产人体内固有的微量生物活性蛋白方面取得 了突破。如，将人类产生：生长激素 红细胞生成素 胰岛素 等基因导入细菌或酵母菌一 类的微生物中进行表达，利,用微生物 生长快、易培养的优点，大量生产这类活性蛋白，用于因体内缺失这类蛋白所致疾病的治疗。这类重组蛋白类药物又称为基因工程药物。,2、在抗生素和药理活性物质生产方面的应用：在这方面也取得了很大进展，并创立了组合生物合成这门新的学科。,组合生物合成是将生产不同抗生素或药 理活性物质中间体的基因 重组到一种微生物中，使生 物合成途径重新组合，生产 迄今自然界还没有的新抗生 素或药理活性物质。如下图：,将放线菌紫素产生菌的,梅得霉素产生菌中,萘醌环羟化基因,导入,重组微生物,获得,新抗生素,产生,梅得紫素A,梅得紫素B,也可应用组合生物合成技术提高已有抗生素的产量或有效组分含量，或生产半合成抗生素中间体。目前，已经工业化或接近工业化的成果是由重组微生物直接生产：7-氨基脱乙酰氧头孢烯酸（7-ADCA）7-氨基头孢烯酸（7-ACA）,以及提高抗生素如：红霉素 头孢菌素 青霉素 等的产量。,二、具有医药品生产价值的微生物,1、自然界已发现的药用微生物类群分布：类群 产生抗生素和药理 所占比例 活性物质大致数量 细菌 1100 11.7 放线菌 6400 68.1 真菌 1900 20.2 合计 9400 100,从土壤中随机 产生的新抗生素和 分离的放线菌：药理活性物质占 链霉菌属占 80-90 70 左右 稀有放线菌占 10-20 30 左右,2、不同的微生物产生不同的抗生素如：芽孢杆菌属的细菌产生的抗生素几乎都是多肽类抗生素。链霉菌属或小单孢菌属产生的抗生素几乎都是大环内酯和多烯大环类抗生素。,3、多数情况下：一类微生物可产生多种抗生素；一种抗生素也可由多种微生物产生。4、研究过的药用微生物占自然界已知属、种的数量：细菌、放线菌为：20-25 真 菌为：10-15 因此，具有医药品生产价值的微生物，今后还会有相当大的开发潜力。,三、药用微生物的分离,从自然界分离具有不同特性的不同类群微生物，是研究它们产生的抗生素和药理活性物质的第一步。自然界生存着无数的微生物，它们中什么样的属种能够产生什么样的有用物质，目前尚无一定规律，从中分离有用的菌种，就像从大海捞针一样。,因此，分离药用微生物：首先要有数量，既每年都要成千上万地对自然界的微生物进行分离；还要有好的方法，能够识别和分离那些不常见的和人工难以培养的微生物属种。,（一）土样的采集和预处理,、土样的采集：要尽可能的选择：各种不同地理和生态环境的土壤及不同深度的土层。2、土样的预处理：分离的微生物不同，处理的方法亦不同。,（1）物理法:A、风干法：简单风干的方法可以大部分排除不产芽孢的细菌，特别是革兰氏阴性细菌；而增加产孢子放线菌的检出机会。,B、干热法：放线菌的孢子耐干热，将风干的土样在干燥状态下加热到120，可杀死不产芽孢的细菌却仍保留放线菌的孢子。注意：放线菌的孢子不耐湿热，加热的极限温度为45-50，小单孢菌可以加热到 60-75,（2）化学法：采用化学处理方法必须考虑所要分离的微生物对所用化学药品的抗性及对不同养分的需要。主要是通过分离培养基进行调节。,（二）分离培养基,1、分离细菌用的培养基：一般采用普通肉膏琼脂培养基。在培养基中：加入亚胺环己酮或其它抗真菌药物，可抑制霉菌的生长。加入多粘菌素可抑制革兰氏阴性菌的生长。,2、分离放线菌的培养基 一般采用:(1)高氏1号培养基(2)葡萄糖-天冬素琼脂培养基：葡萄糖 10 g 天冬素 0.5g K2HPO4 0.5g 琼脂 15-20g pH 7.0 蒸馏水 1000ml 抑制不同杂菌加入不同药品,（1）加入制霉菌素或亚胺环己酮抑制霉菌。（2）不加蛋白胨和氨基酸可限制芽孢杆菌的发芽。（3）胶体壳多糖琼脂培养基可使孢囊菌属放线菌优先生长；也被用来选择性地分离小单孢菌。,（4）用腐殖酸作为碳源、氮源，辅以各种维生素，可以分离得到多种不同属的放线菌，而且孢子生长良好。典型培养基配方为：,腐殖酸1.0g（溶于10ml0.2mol/LNaOH溶液中）Na2HPO4 0.5g、KCl 1.7g、MgSO47H2O 0.05g、FeSO47H2O 0.01g、CaCO30.02g、亚胺环己酮50mg、复合维生素溶液10ml（内含盐酸硫胺素、核黄素、盐酸比多醇、肌醇、泛酸钙、对氨基苯甲酸、烟酸各0.5mg;生物素0.25mg，过滤除菌），琼脂18g、加蒸馏水至1000ml、pH7.2。,分离海洋放线菌可采用以下两种培养基：（1）可溶性淀粉10 g 酪蛋白1g 海水 500ml 蒸馏水500ml 琼脂 15-20g pH 7.4-7.6（2）蛋白胨 5g 磷酸铁 0.1g 酵母提取物 1g 海水 1000ml 琼脂 15-20g pH 7.4-7.6,加入某些特定的抗菌剂可以分离得到一些特殊的放线菌属、种，如马杜拉放线菌、小单孢菌等。采用贫乏培养基可以减慢生长快的微生物的生长速度，给生长慢的微生物留下一些生长空间，故分离的菌落种类一般多于丰富的培养基。,分离平板培养基表面的水分有利于革兰氏阴性细菌的生长和扩散，影响放线菌孢子的发芽和生长。因此，分离平板培养基配制好后，应在37下孵育一段时间，待表面不存在肉眼可分辨的水雾后才可使用。,3、分离真菌的培养基：一般采用查氏培养基。加氯霉素、或四环素或其它抗细菌抗生素，可以排除大部分细菌的生长。大家应该注意的是：不存在能够分离各种微生物的万能培养基。为了尽可能获得更多属、种的微生物，应当同时使用多种分离培养基。,（三）分离方法,1、水悬浮稀释法稀释混合平板法（湿法分离）2、干土喷射法：（干法分离）用一种特制的喷土器将研碎的干土样直接喷射到分离平板上，根据：土样的多少、喷射距离的远近、喷射角度、来调节每个平板的喷射量。,此种方法比湿法分离，简单、方便，不同的喷射角度还有可 能分离得到不同的放线菌。但对喷射量的掌握要经过一段时间的经验摸索。,3、孢子飞扬法：是将土样放在一种瓶口刚好能倒扣在一个分离平板的特制瓶中，剧烈振荡使孢子飞扬，撞在分离平板上，进行分离培养。可分离得到许多典型的放线菌属。,4、微孔滤膜法：在分离培养基表面覆盖孔径为0.45m的微孔滤膜，然后将土样接种到滤膜上，在室温下培养一段时间。丝状放线菌可以透过滤孔，深入到下面的培养基中生长，而单细胞细菌停留在滤膜表面。揭取滤膜后继续培养，琼脂平板上长出得差不多全是放线菌菌落。这是选择性 的分离放线菌的一种十分简便的方法,（四）、培养时间和温度,分离的目标菌不同，培养时间和温度不同。一般：细 菌：37 3-5天 真 菌：25-28 5-10天 放线菌：28-30 2-4周,（五）菌种纯化,平板上长出的各种单菌落如果过于密集，为防止不同菌落之间相互污染，需要将菌落挑出后再进行平板分离。确认获得比较纯的单菌落后，接种斜面，进行代谢产物的筛选和短期保存。,第三节 微生物药物的研究与开发,一、微生物药物研究开发的一般程序二、微生物药物的筛选方法三、微生物药物的安全性与有效性评价,一、微生物药物研究开发的一般程序,以从自然界分离各种微生物菌株开始的微生物药物的研究与开发，是一个漫长的过程，主要包括以下步骤：,样品采集,平板分离,斜面培养,摇瓶发酵,一次筛选,有无活性,小发酵罐发酵,提取,粗提物（20-50）,二次筛选,有无活性,纯度（纯度）90,稳定性研究,是否稳定,其他模型筛选,放弃,化学修饰或放弃,动物药效学研究,理化性质和化学结构研究,无,无,有,产生菌鉴定,长期保存,是否新化合物,是否有效,是否新药理活性,是,专利申请,否,否,是,否,放弃,是,放弃,毒理研究,药动学和药代学研究,制剂研究,是否符合要求,否,化学修饰或放弃,是,工艺研究,专利申请,是,临床试验,是否安全有效,否,放弃,是,报批生产,上市,否,是,（23年）,（36年）,二、微生物药物的筛选方法,得到产药物的微生物后，还要从这些微生物的代谢产物中把我们所需要的药物筛选出来。药物筛选是指应用精心设计的各种模型，在浩如烟海的成千上万个代谢产物中，将所需要的药理活性物质鉴别出来的过程。是新药研究的最初过程和关键步骤，其目的是发现新药。,（一）、药物筛选模型：1、药物筛选模型的概念：药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，这些实验方法是寻找和发现药物的重要条件之一。,人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极作用。每一种模型都源于一种新技术的诞生。这些模型各有利弊，要根据具体的试验选择合适的模型。,2、模型的标准：一个好的筛选模型要求能够：简单、快速、灵敏、特异地检出需要的活性物质，同时可以有效地排除已知化合物。并且所有的模型都必须满足进行高通量筛选的需要。（适合于大规模筛选）,3、模型的种类：（1）、微生物学模型:是最简单、曾经应用最广泛、最适合于高通量筛选的模型。并且在抗菌物质 的筛选中发挥过极其重要的作用，在其他药理活性物资的筛选中也有过一定的价值。,（2）、整体动物模型：是最直观有效的模型 整体动物模型就是以动物作为药物筛选的观察对象，以动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。由于正常动物并不能充分反应药物在病理条件下的治疗作用，在药物筛选中应用更多的是动物病理模型。理想的动物模型应具备的基本条件是病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。,整体动物筛选模型的最大优点是可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、不良反应以及毒副作用。由动物模型获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床效果、毒副作用和应用前景具有十分重要的价值。整体动物筛选法的缺点：由于动物的特殊性，决定了药物筛选过程主要依赖于手工操作，而且只能对有限的样品进行筛选，使动物模型筛选新药具有明显的局限性，效率低、成本高。,（3）、组织器官水平的筛选模型 随着现代医学和现代药理学的发展，采用动物的组织、器官制备的药物筛选模型越来越多，如离体血管实验，心脏灌流实验、组织培养实验等方法。通过观察药物对特定组织或器官的作用，可以分析药物作用原理和可能具有的药理作用。组织、器官水平的筛选模型可以反映生理条件下的药物作用，也可以制备成病理模型，观察药物对病理条件下组织器官的作用。应用组织器官模型筛选药物，是药物筛选技术的一大进步。,离体组织器官模型的优点：降低了筛选样品的用量；降低劳动强度，扩大筛选规模；减少动物用量，特别是有些模型仅使用一小部分组织器官，同一时间内可以进行多样品的筛选，提高了筛选效率，降低了筛选成本；减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。组织器官水平的筛选模型进行药物筛选也存在明显的缺点：规模小、效率低、反应药物作用有限、不易实现一药多筛。此外，人工操作技术要求高等也是影响其在药物筛选中应用的主要原因之一。,（4）、生化模型：随着疾病的生化机理被不断阐明，生化模型开始用于药理活性物质的筛选。但因许多生化反应目前在体外难以进行，使这一方法的应用也有一定的局限。,（5）、细胞、分子水平药物筛选模型 由于近年来分子生物学技术和细胞生物学技术的快速发展，分子药理学研究也不断深入，新的药物作用靶点、功能蛋白质、基因表达的变化，生物活性成分等不断发现，为药物筛选提供了大量新的靶点，这些新的靶点为新药筛选提供了新的信息和机会。细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础，使药物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选。,高通量药物筛选的优点：实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的概率，同时提高了发现新药的质量；筛选实验是在微量筛选系统中完成的，样品用量一般在微克级(g)，节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本；高通量药物筛选为高度自动化操作减少了操作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性；具有多学科理论和技术结合的特点。,高通量药物筛选的缺点：高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；用于高通量筛选的模型总是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。,药物筛选模型是发现新药的重要条件。新模型的建立将会带动新型药物的出现。分子生物学、细胞生物学、计算机科学的发展，特别是人类基因组计划的完成，为医药研究带来了良好的机遇，也为建立新的药物筛选模型，提供了理论、技术、材料等多方面的优势条件。因此，我们应充分利用各学科的发展技术建立更多新的筛选模型，促进新药的发现。,（二）、药物筛选的种类,1、-内酰胺类抗生素的筛选-内酰胺类抗生素:是指化学结构中含有-内酰胺环并具有抗细菌活性的一类天然和合成化合物的总称。作用机理：特异性的抑制细菌细胞壁的 合成。因此，对无细胞壁结 构的哺乳动物细胞几乎没有 毒性。,（1）、-内酰胺类抗生素超敏感菌株的应用：超敏感菌株的制备：,N-甲基-N-硝基亚硝基胍,三步诱变,超敏感突变株,铜绿假单胞菌,出发菌株,头胞菌素C对超敏感菌株的最低抑制浓度：出发菌株:1000g/ml 超敏感突变株：0.05g/ml 该突变株对-内酰胺以外的抗生素敏感性无明显变化，故可用于特异性地检出-内酰胺类抗生素。,（2）、检菌细胞形态变异的应用：由于-内酰胺类抗生素抑制细胞壁的合成，从而可使细菌发生各种形态变化，如：细胞延长