基因芯片技术PPT课件.ppt

十 基因芯片技术,1 生物芯片简介及分类 2 基因芯片制备及应用,第一节 生物芯片简介及分类,一、生物芯片(biochip)的概念 指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。,二、生物芯片的分类,(一)按载体材料分类玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。(二)按点样方式分类原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片。原位合成芯片：它将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，从而制备成芯片。,微矩阵芯片：将用PCR或化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点方法直接排列到玻片等载体，从而制备成芯片。特点是密度高、制作方便。电定位芯片：是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上，从而制备成芯片。特点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。,(三)按芯片固定的生物分子类型分类基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室 基因芯片技术(gene chip):就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。,DNA芯片技术,基因芯片杂交结果图,蛋白质芯片(protein chip):就是选择一种能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质(抗原或抗体)，形成蛋白质的微阵列，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子(抗原或抗体)，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。,芯片实验室(lab-on-chip):是将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上,这种技术称为芯片实验室。,(四)按芯片的使用功能分类测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片,第二节 基因芯片制作及应用,一、基因芯片技术的概念就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。,二、基因芯片的基本原理,基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体讲即是将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。,基因芯片发展历史,Southern&Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,三、基因芯片的制备,基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制作、样品制备、分子杂交、信号检测与结果分析。,Comparison of DNA Chip Technology,Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,（一）芯片的制备,基因芯片种类较多，主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类原位合成和预合成后点样。预合成后点样：是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂在基体上。原位合成：是指利用光导合成的方法在载体表面上逐个合成寡核苷酸，合成后点样可能将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。,1 支持物的预处理,载体材料要求：载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。,支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。,2 芯片的制作,目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法、喷墨法、原位合成法。接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。,喷墨法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。,原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长，在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。,（二）样品的准备,样品的分离纯化：DNA,mRNA扩增：PCR,RTPCR，固相PCR探针的标记：已克隆的基因片段、PCR，RT-PCR扩增的基因片段、人工合成的DNA片段，单链、双链、DNA或RNA 均可作为探针。荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记,通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对探针的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片,一般需要从细胞和组织中提取RNA,进行逆转录,并加入偶联有标记物的dNTP,从而完成对探针的标记过程。,高密度芯片的分析一般采用荧光素标记探针，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的探针用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱，常用的双色荧光试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。,探针的固化：打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。,(三)分子杂交,该反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交，产生检测信号的过程。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成,可同时平行检测许多基因序列。影响杂交反应的因素：靶分子的浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度、杂交温度和反应时间、DNA二级结构等。,(四)信号检测与结果分析,芯片经杂交反应后，各反应点形成强弱不同的光信号图像，用芯片扫描仪和相关软件加以分析，即可获得有关的生物信息。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影；若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。,基因芯片扫描结果,不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫,信号检测与结果分析,激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理,Genomic DNA,四、基因芯片的特点,微型化和自动化。现已出现的芯片面积最大不过525cm,最小仅有1cm,;每个阵列中阵点样品DNA的用量仅为5nl(0.5g/L)左右;同时杂交和洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。高度平行性。基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验结果具有可比性.巨大的信息产出率。在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、时间与空间上的差异及遗传信息。,高度敏感性和专一性。能可靠并准确检测出10 pg/L的DNA样品。高度重复性。一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。强大的类比性。使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成。哺育新的实验方法。此技术易与其它常规生物技术相融合交叉。基因芯片这些独一无二的特点也代表了后基因组时代技术的发展方向。,五、基因芯片的应用,基因表达分析：人类基因组编码大约100,000个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA的实验工具很重要。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因。,基因表达谱芯片应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述。,进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。,基因型及多态性分析：利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上，采用PCR扩增基因组DNA，其一条引物用荧光素标记，另一条引物用生物素标记，分离两条互补的DNA链，将荧光素标记DNA链与微阵列杂交，通过荧光扫描检测杂交模式，即可测定PCR产物存在的多种多态性，该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析，结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。,杂交测序：人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization,SBH)技术及邻堆杂交(contiguous stacking hybridization,CSH)技术即是一种新的高效快速测序方法。用含65,536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200bp长DNA序列，采用67,108,864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于13聚寡核苷酸微阵列的作用。可测定数千个核苷酸长的DNA序列。,基因芯片测序流程,疾病的诊断与治疗：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型；极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。,药物研究与开发：芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。目前，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和开发。,基因功能研究：在基因组学和后基因组学研究中，基因芯片也起到重要的作用。应用基因芯片可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性（SNP）测定等研究。与传统的Northern blot杂交或点杂交方法相比，基因芯片技术具有大规模平行处理的能力。,在营养与食品卫生领域的应用：采用基因芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将为揭示肥胖的发生机制及预防打下基础。还可用于营养与肿瘤相关基因表达的研究，如癌基因、抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关系的分子水平研究。再者，食品营养成分的分析、食品中有毒、有害成分的分析和检测等。,在环境科学领域中的应用：在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。,农业和畜牧业：利用基因芯片技术，对有重要经济价值的农作物和水果等的基因组进行大规模高通量的研究，筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产品。也可利用基因芯片技术筛选、开发高效低毒的生物农药。,军事和司法：美国以有部分公司得到政府的资助开发生物战病原体检测系统。在司法领域，国外的公司正在开发便携式DNA芯片检测装置，它可以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较，以尽快、准确的破案。我国上海的司法部司法鉴定科学技术研究所第一个“罪犯DNA数据库”在99年9月7日通过了专家鉴定，利用DNA破案将成为一种重要的破案手段。另外，基因芯片还可作亲子鉴定等方面的工作。,本章重点掌握的内容,掌握生物芯片、基因芯片技术、芯片实验室、原位合成法的概念。掌握生物芯片按芯片固定的生物分子类型和点样方式的分类。掌握基因芯片的工作原理及制备基本步骤。,DNA芯片技术,第一节、基因芯片,一、什么是基因芯片（Genechip）1、所谓基因芯片是指将大量探针以很的高密度分子固定于支持物上，然后与标记的核酸样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，也可还可以用于核酸样品的序列分析。,基因芯片杂交结果图,2、基因芯片的工作原理标记的待测分子与被固定的探针杂交。3、基因芯片的特点：探针数量多密度高，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析。常用支持物常：玻璃片，聚丙烯酰胺板、金属片、硅片等，玻璃是最常用的材料。,常用的待测分子,PCR产物：序列分析,RT-PCR产物：基因表达分析,基因芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,第二节、基因芯片的制作,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,光引导原位合成,分子印章法,分子印章法,针式点样,喷墨点样,一、针式点样1、玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。2、点样针沾取探针溶液。3、点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。4、针式点样的优缺点优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。缺点：定量准确性、重现性不好,2202芯片点样仪生产商 Bio-Rad性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴)，重复性：3um 球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量82,000个点,二、喷墨点样喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。,三、中国科学家对基因芯片发展的贡献 东南大学吴健雄实验室的陆祖宏教授创造了分子印章点样技术，并取得专利。至今已取得芯片制作、芯片检验方面的专利35项。,第三节、基因芯片的使用流程,以HLA基因多态性为例一、待测分子的获得与标记 1）提取患者基因组DNA 2）DNA样品PCR扩增并进行标记。,常用标记物为荧光素。1.末端标记：在引物上标记有荧光素，在DNA扩增过程时，使新形成的DNA链末端带有荧光素。2.随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光素，在PCR过程中，带有荧光素的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。,二、杂交过程类似于一般的杂交法。把要杂交的分子的溶液覆盖芯片的探针，用盖玻片覆盖，即可杂交。,杂交温度的选择极关键。,芯片杂交炉（Hybridization oven)生产商 Affymetrix全自动控制芯片的杂交过程。温度控制精确，芯片舱的转动提供充分的混合。该杂交炉可以同时处理64张芯片。,三、基因芯片的扫描 基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统读取。,B,B,A,C,D,E,放大器,数模转换器,计算机,A:激光器 B:滤光片 C:二色镜 D:反光镜 E:关栅,Scanner ArrayScanner Array扫描仪采用氩离子激光器来激发与目的DNA结合的荧光分子来产生定量的杂交信号。Scanner Array扫描仪扫描芯片上成千上万的探针。扫描的同时给出高分辨率的实时的图像，同时荧光亮度的数据储存在原始文件中。激光源:488 nm 氩离子激光器激光束直径：3微米 检测指标：样品点直径：20微米支持的染料：荧光素分辨率：3微米 预扫描时间：最长2 分单次扫描时间：最长4分钟（12.8mm x12.8 mm）,基因芯片扫描结果,不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫,四、结果分析当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，数据文件就被定量和翻译，通过重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，选出杂交点，并定量。,Genomic DNA,基因芯片具有什么优点与 缺点？,4、生物芯片的优点1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。节省时间。2）微型化，实验所需试剂用量少3）高度自动化5、缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。,生物芯片于一般分子杂交比较,第四节、基因芯片在医学领域的应用,一、基因芯片可应用于疾病诊断 1）肿瘤的基因诊断 例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。2）用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了-地中海性贫血的检测芯片3）用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。,二、用于组织配型例：上海复旦长将生物医药股份有限公司开发了HLA分型芯片，目前已在国内各大血站投入应用。三、药物研究,小结,生物芯片给生物学带来革命性的推动，对于一个国家有战略性的意义。我国在生物芯片的应用上多有努力，但在生物芯片的相关技术上还努力的不够。,