黄酮类化合物的检识与结构鉴定.ppt

第四节黄酮类化合物的检识与结构鉴定,目前主要采用的方法有：与标准品或与文献对照PPC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）分析对比样品在甲醇溶液中及加入诊断试剂后得到的UV光谱1H-NMR 13C-NMR MS,一、色谱在黄酮类鉴定中的应用,1.纸层析(PPC)苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（正丁醇：醋酸：水4：1：5上层）；第二相展开用水性溶剂，如氯仿：醋酸：水（3：6：1）苷元则多采用醇性溶剂。花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂。显色剂：2%三氯化铝甲醇液（紫外光下检测）；1%FeCl3/1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。,2.薄层层析(TLC),）硅胶薄层 用于弱极性黄酮较好。常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲醇（95：5）或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等。,）聚酰胺层析适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类。常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。一般程序：测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型；在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UV谱和可见光谱以了解3,5,7,3,4有无羟基及邻二酚羟基；苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。,（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱,多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起。,B,B,带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。,A,A,不同类型黄酮类化合物的紫外光谱,2加入诊断试剂后引起的位移及结构测定,说明：,（1）+NaOMe或NaOAc,OHONa，变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加，红移 另有3,4-OH或3,3,4-OH时，在NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。（2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4-OH解离。,（3）,形成络合物的能力：黄酮醇3-OH 黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）邻二酚羟基 二氢黄酮醇5-OH邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多。,（4）根据只加AlCl3和加入AlCl3及盐酸的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况。,山柰苷 山柰酚UVmax(nm)带II 带I 带II 带IMeOH 265 345 267 367NaOMe 265 388 278 416（分解）AlCl3 275 399 268 424AlCl3/HCl 275 399 269 424NaOAc 265 399 276 387NaOAc/H3BO3 265 345 267 367,从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后，用PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光谱数据如下：,山柰酚3，7-二鼠李糖苷,三、1H-NMR,常用溶剂：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定。,黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)羟基的特征,5OH：12 ppm7OH：11 ppm3OH：10 ppm,氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对鉴别黄酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂，在试样中加入重水（D2O）羟基质子信号消失。,（一）A环质子,15,7-二-OH黄酮,黄酮类1H-NMR（三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定）,当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移。,27-OH黄酮,H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8较5,7-二OH黄酮在较低场，且相互位置可能颠倒。,（二）B环质子 6.5-8,14-氧取代黄酮类化合物,H-3,5 6.5-7.1,d,J=8.5HzH-2,6 7.1-8.1,d,J=8.5Hz由于C环对H-2,6的负屏蔽作用大于对H-3,5，且H-3,5受4-OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2,6处于越低场的位置。,23,4-二氧取代黄酮类化合物,H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6 也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6 H-2 H-5。但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。,（1）3,4-二氧取代黄酮及 黄酮醇H-5 6.7-7.1 d,J=8.5HzH-2 7.2 d,J=2.5HzH-6 7.9 dd,J=2.5,8.5Hz,（2）3,4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及 二氢黄酮醇 H-2,5,6常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰）,33,4,5-三氧取代黄酮类化合物,若R1=R2=R3=H，则H-2,6为单峰，若上述条件不成立（如3或5甲基化或苷化时），则H-2,6分别为二重峰（J=2Hz）,（三）C环质子,1.黄酮类,2.异黄酮类,H-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，。若用DMSO-d6作溶剂，则。,3.二氢黄酮和二氢黄酮醇,1)二氢黄酮,两个H-3,分别为dd峰，中心位于2.8，J=17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J=17Hz（偕偶），11Hz（反偶）,H-2,dd,5.2,Jtrans=11Hz（反偶）,Jcis=5Hz（顺偶）,（2）二氢黄酮醇,3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的值升高（向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。,H-2与H-3为反 式双直立键，J=11HzH-2 4.9H-3 4.3,H-：6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-：7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0),查耳酮：,苄氢:6.50-6.70(1H,s)6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6),橙酮：,（四）糖上的质子,1.单糖苷类 糖与苷元相连时，糖上1-H与其它 H比较，一般位于较低磁场区。因-OR(R=苷元)不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（）,1）葡萄糖位于不同位置时端基H化学 位移的区别：C3-OR 1-H的 值约为5.8 C-5,C-6,C-7,C-4-OR 1-H的 值约为,2)葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别 黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.8,d,J=7Hz（二直立键偶合系统）黄酮醇3-O-鼠李糖苷5.0-5.1,d,J=2Hz（二平伏键偶合系统）另外鼠李糖上的C-CH3 0.8-1.2,d,J=6.5Hz,化合物 糖上的H-1黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.70-6.00黄酮醇7-O-葡萄糖苷 黄酮醇4-O-葡萄糖苷 黄酮醇5-O-葡萄糖苷 黄酮醇6及8-C-糖苷黄酮醇3-O-鼠李糖苷 二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷 二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷,糖上的氢,2.双糖苷类末端糖上的H-1因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而较H-1处于较高场的位置。,取代基 甲基 2.04-2.45(3H,s)乙酰氧基 2.30-2.45(3H,s)甲氧基 3.45-4.10(3H,s),苯环上其他取代基的氢：,四、13C-NMR,方法：（1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较；（2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算；（3）选用各种一维和二维NMR技术。,（一）骨架类型的判断,根据中央三碳链的碳信号，即先根据羰基碳的值，再结合C2、C3在偏共振去偶谱中的裂分和值判断。,（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法,黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：,1取代基位移的影响,-OH及-OCH3的引人将使直接相连碳原子(-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(-碳)及对位碳则向高场位移。间位碳虽也向低场位移，但幅度很小。,A-环上引入取代基时，位移效应只影响到A环，而B-环上引入取代基时，位移效应只影响到B环。若是一个环上同时引入几个取代基时，其位移效应将具有某种程度的加和性。,黄酮母核上引入5-OH时，不仅影响A环碳原子的化学位移，还因C5-OH与C4=O形成分子内氢键缔合，故可使C4，C2信号向低场移动(分别为+4.5及+0.9)，而C-3信号向高场移动(2.0)。C5-OH如果被甲基化或苷化(氢键缔合遭到破坏)，则上述信号将分别向高场位移。,25，7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征,对大多数5，7二羟基黄酮类化合物来说，C-6(d)及C-8(d)信号在9001000的范围内出现，且C-6信号总是比C-8信号出现在较低的磁场。在二氢黄酮中两者差别较小，约差09个化学位移单位，但在黄酮及黄酮醇中差别较大，约为4.8。C-6或C8有无烷基或者芳香基取代可通过观察13C-NMR上C-6，C-8信号是否发生位移而加以认定。,生松素(pinocembrin)及其6-C-甲基及8-C-甲基衍生物的C-6，C-8,木犀草素(1uteolin)，即使因其C6上联接的H被-OH取代而向低场大幅度的位移，C-8信号也未因此而发生大的改变。,(三)黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,1糖的苷化位移及端基碳的信号 酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移约为+4.0+6.0。黄酮苷类化合物当苷化位置在苷元的7或2、3、4时，糖的C-1信号将位于约100.0102.5范围内。5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相应的C-1信号分别出现104.3及99.0处.。,黄酮类双糖苷或低聚糖苷的13C-NMR中，糖的端基碳信号出现在98.0109.0区域内，常与C-6，C-8，C-3及C-10混在一起而不易区别。可采用HMQC(1H-detected heteronuclear multiple-quantum coherence)等二维核磁共振技术鉴别。,2苷元的苷化位移,苷元苷化后与糖直接相连碳原子向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大而且恒定。C-5-OH糖苷化后，除上述苷化位移效应外，还因C5-OH与C4O的氢键缔合受到破坏，故对C环碳原子也将发生巨大的影响。C2，C-4信号明显地向高场位移，而C-3信号则移向低场。,(四)双糖苷及低聚糖苷中分子内苷键 及糖的联接顺序,（1）当糖上的羟基被苷化时将使该-OH所在碳原子产生一个相当大的向低场位移。例如在黄酮类化合物芦丁苷元-O-D-glucosyl-(61)-L-rhamnoside)中，葡萄糖的C6信号将向低场位移5.8，但C-5则向高场位移约1.4。,（2）黄酮类双糖苷及低聚糖苷中糖的联结顺序常采用HMBC(1H-detected heteronucler multiple-bond-coherence)二维核磁共振技术进行确定。,五、质谱在黄酮类结构测定中的应用,多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定。,但是当测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，则采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰M+及具有偶数电子的准分子离子峰(quasi-molecularion peak)M+H+。,(一)黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱(El-MS),黄酮类化合物苷元的El-MS中，除分子离子峰M+外，也常常生成M-1+即(M-H)基峰。如为甲基化衍生物，则可以得到M-15+即(M-CH3)离子。,黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：,途径-I（RDA裂解）：120 102,途径-II,此外，还有分子离子M+.生成M-1+，(M-H)及M-28+.(M-CO)；由A1生成A1-28+.，(A1-CO)及B2生成B2-28+，(B2-CO)等碎片离子。,1黄酮类裂解基本规律：,A-环的取代图式可通过测定A1+.的m/z的值进行确定。同样，根据B-环碎片离子的m/z值，也可精确测定B环的取代情况。,一些黄酮类化合物的质谱数据,黄酮在有四个以上氧取代基时，常常给出中等强度的A1及B1碎片，它具有重要的鉴定意义；但是黄酮醇则不然，当氧取代超过四个以上时，只能产生微弱的Al+.及Bl+.碎片离子。,在3，6及8-位含有C-异戊烯基的黄酮类，除一般黄酮裂解途径外，还产生一些新的碎片离子。如：化合物(I)中A环上的，-二甲烯丙基在裂解过程中脱去C4H7碎片，并重排成稳定的卓瓮离子()。,在6-及8-位含有甲氧基的黄酮可失去CH3，得到M15+强峰(常为基峰)，随后又失去CO，生成M-43离子：,2黄酮醇类质谱,多数黄酮醇苷元，分子离子峰是基峰，在裂解时主要按途径-进行，得到B2+离子，继续失去CO形成的B2-28+.离子。与途径相比，途径I通常不太主要。其中，A+H+是来自A-环的主要离子，其上转移的H来自3-OR基团。,在黄酮醇全甲基化衍生物的质谱图上，B2+离子应当出现在m/z105(B环无羟基取代)，或135(-OCH3，示B环有一个羟基)，或165(有两个-OCH3，示B环有两个羟基)或195(有三个-OCH3，示B环有三个羟基)等处，其中最强的峰即为B2+离子。,具有2-OH或2-OCH3的黄酮醇类在裂解时有个重要特点，即可以通过失去OH或 OCH3，形成一个新的稳定的五元杂环。,(二)黄酮苷类化合物的FD-MS,黄酮苷类化合物在EI-MS上既不显示分子离子峰，也不显示糖基的碎片，故不宜用 EI-MS测定。而FD-MS谱可给出强烈的M+及M+H+。还给出葡萄糖基的某些碎片，为化合物的结构鉴定提供了重要的信息。,在FD-MS中，因为(M+23Na)离子的强度随着溶剂极性及发射丝电流强度的改变而变化，可用以帮助区别分子离子峰(M)+及伪分子离子峰M+1+。,小结：第一节 概述包括（黄酮类化合物的结构分类、生物活性）掌握黄酮类化合物的的定义、基本结构、分类和代表化合物。第二节 理化性质和显色反应掌握黄酮类化合物的颜色、旋光性、溶解度的特性及与结构之间的关系，掌握黄酮类化合物的酸碱性，酸性强弱与结构之间的关系及在提取分离中的应用，掌握显色反应与结构之间的关系及应用。,第三节 提取分离掌握黄酮类化合物的一般提取方法、PH梯度分离法与结构之间的关系，掌握黄酮类化合物聚酰胺柱层析法、硅胶柱层析法和凝胶过滤法的原理以及它们与结构之间的关系,第四节 结构鉴定 掌握黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、查耳酮和橙酮的母核紫外光谱特征，掌握加入各种诊断试剂的黄酮类化合物的解析规律、熟悉黄酮类化合物检识的色谱方法。掌握黄酮类化合物氢谱、碳谱的基本特征及其在结构鉴定中的应用，熟悉黄酮类化合物质谱的基本特点。,