食源性生物活性因子的发现与研究.ppt

第二章 食源性生物活性因子的发现与研究,可以说，中国古代人早就注意到“病从口入”的道理，而且最早通过饮食调理来治疗常见疾病，保障人体健康。其实中国的中草药也是通过吃和偿来找到和发明的。近年来，人们发现，食品，特别是乳制品中的确含有各种生物活性肽，这些生物活性肽可以发挥各种生理功能，并取得了大量研究成果，另一方，从免疫学的角度来看，动物的免疫系统也存在一个悖论：那就是获得性免疫到底对动物的生存是怎么起作用的？假如有一种致命的疾病流行，我们知道，因为这是一种新的流行病，所以所有相应的动物都对此病原体没有获得性免疫，那么其生存的机会只会留给对此病有先天免疫作用的动物，不能抵御该病原体入侵的动物显然会被淘汰。于是从逻辑上来讲，只有对该病原体有抵抗能力（先天免疫）动物才有机会生存10天以上，从而获得对该病原体的获得性免疫力。那么，获得性免疫对动物的生存，特别是受致命性的病原体感染时的生存起什么作用呢？显然，获得性免疫一定是对动物生存起重要作用的，否则动物，特别是高等动物就不会进化成如此完善的获得性免疫系统，我们称此矛盾为“获得性免疫悖论”（adaptive immune paradox）。本书作者认为：获得性免疫可以通过下列两个方面对动物的生存和进化起重要作用：,1、通过母乳喂养对其幼仔起作用：哺乳动物母乳中含有母亲在数十年的生存和与疾病作斗争中所获得的体液免疫-抗各种病原体的抗体以及和T细胞活性相关细胞因子、淋巴因子等，这些获得性免疫成分都可以通过母乳传递给她的幼仔，从而大大增加其生存能力。2、肠胃道中的免疫接种系统：只要我们不接受关于食品可以产生免疫耐受的观点，我们就可以不难看出，消化道实际上是一个最大的免疫接种系统，当病原体通过“病从口入”进入胃肠道以后，几乎所有的病原体将面临致命性的先天免疫系统的攻击：首先是口腔中拒绝作用，其次是酶和一氧化氮的杀菌作用，第三是胃酸的作用，胃蛋白酶的作用，第四是胆汁的作用，第五是各种酶的消化作用，第六是肠粘膜和绒毛的机械清除作用，第七是先天免疫作用，这些作用将会杀死几乎所有病原体，从而起到免疫接种作用，而且不会造成感染，因为此时的病原体已经失去了感染能力。在机体获得了这种获得性免疫能力之后，如果相同或相似的病原体再从其它途径入侵机体时，机体就可以激活其获得性免疫系统彻底消灭入侵者。,第一节、初乳中的生物活性物质及其生理作用,初乳和原料乳含有脂肪、蛋白质、乳糖、和矿物质，它们是哺乳动物的重要营养成分。初乳还含有各种维生素、免疫球蛋白、激素、生长因子、细胞因子、酶和其它生物活性肽。这些物质是从乳房的泡状上皮细胞和免疫细胞代谢而来，哺乳动物的种类、年龄和健康状况对这些成分有一定的影响。初乳的组成和常乳有很大不同，因为它要满足新生儿的需求。牛初乳是牛分娩以后几天内分泌的乳汁。其对于新生牛犊健康的重要性是早就肯定了的。初乳除含有常乳中所具有的营养、蛋白、脂肪、乳糖和矿物质外，还含有生长因子和抗微生物的因子，有些因子虽然在常乳中也有，但是其含量远远低于初乳。在牛初乳中，最丰富的和了解最多的生长因子当属IGF-I 和IGF-II。它们可以刺激细胞生长，通过血液作用于内分泌激素，发挥副激素(paracrine)和自激素(autocrine)的作用。IGF-I是牛初乳中的主要形式，其浓度为7-67 nmol/l，而正常的奶中含量则只有0.3 nmol/l，在正常的成人血清中，其含量为7 nmol/l，IGF-I有很强的刺激肌肉组织合成代谢的作用，与生长激素的反馈调节有关。IGF-I可以模仿大多数，但不是全部生长激素的作用。有证据表明，骨骼肌的生长就是由IGF-I介导的。牛初乳中的抗菌活性因子包括免疫球蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、和乳铁蛋白等。牛初乳富含免疫球蛋白，是新生牛犊的免疫球蛋白的主要来源。初乳中IgG、IgM和IgA的含量比常乳高上百倍。,表2.1 奶牛分娩后2天和4周的奶的成分比较。*代表差异高度显著(P 0.05)。,A,B不同的大写字母表示组分存在显著性差异(P 0.05)。,表2.2 初乳中的激素、-GT和IgG（分娩2天）,初乳和常乳总蛋白质的不同主要是由于IgG的含量不同，其他生物活性因子，如乳铁蛋白、乳转铁蛋白、乳球蛋白等在初乳中也明显高于常乳。总乳蛋白在常乳中下降可能部分地与增加产乳量的稀释作用有关。IGF-I的浓度在由初乳到常乳的转变过程中迅速下降。泌乳刺激因子可能是在泌乳时从血液进入乳中的。TNF-的浓度在初乳中显著高于常乳。TNF-也具有趋化活性，这可能与体细胞从血液进入乳有关。由乳中的体细胞所表达的这些TNF-可能会增加局部的免疫活性。因此，TNF-可能部分是由体细胞产生的，进一步控制细胞进入乳中的流动。已知-GT是定位在滤泡细胞外膜上的，它可以促进有些氨基酸跨过滤泡细胞膜的吸收。-GT 的活性在初乳中要比常乳中高出很多。IgG的浓度在初乳中也比常乳高出很多，表明通过上皮分泌细胞和滤泡细胞紧密相连，抗体从血液流到乳汁。初乳期以后，IgG 则通过转运细胞的选择性受体介导向乳汁中的转运。Na和Cl的浓度和IgG密切相关,虽然其转运机制和IgG并不相同,在通过上皮细胞时的控制显然起主要作用。,初乳中主要生物活性因子及其生物活性,如上所述，初乳中很多对生长、分化和各种生理功能起作用的生长的因子。以下对这些因子及其功能进行简单介绍：,1、非肽类营养因子 初乳里含有一系列的非肽类营养因子，具有重要的生物功能。这些因子包括：谷氨酰胺、多胺、低聚糖、核苷酸等。其是否作为生长因子尚存在争议，但是它具有促进细胞增值的作用却是肯定的。推测这些因子可能是某些种类受体的配基，或作为第二信使起作用。象谷氨酰胺这种因子就经常作为首选底物。无论如何，这些因子在保持肠胃道平衡和通过多种机制调节免疫系统中起重要作用,例如，它可以改变肠道微环境，作用于生长因子的活性等。再如，EGF对于小鼠小肠细胞系IE6的营养应答就需要谷氨酰胺的存在。,2、激 素 研究显示，初乳中含有多种激素。将这些因子注射可以对多种器官和系统起作用。这些系统包括：下丘脑-脑垂体系统,因为其含有泌乳刺激素(prolactin)、生长激素抑制素(somatostatin)、黄体激素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone)、缩宫素(oxytocin),甲状腺,因为乳中含有甲状腺刺激激素(thyroid-stimulating hormone)、甲状腺素(thyroxine)、降血钙素(calcitonin),性腺,因为奶含有雌激素(estrogen)和黄体酮(progesterone),和肾上腺、胰腺。可能有一些激素，例如黄体激素释放激素，作用于乳浆的浓度，从而作用于新生儿的发育,因为这些激素可以通过肠壁细胞吸收进入血液循环。这些激素似乎很少影响成年人，因为成年人限制其通过肠壁细胞吸收到体内。但是，当成年人的肠道有损伤时，这些因子可能对病人有作用，例如克隆病(Crohn Disease)即局限性肠炎，由于肠道的损伤，故这些生物活性物质可以通过肠壁细胞达到他们的受体从而介导病理生理作用。,3、细 胞 因 子 作为细胞因子的蛋白质具有多种细胞学功能。以pM到nM的浓度作用于很多细胞。一般来讲，细胞因子不能控制正常的动态细胞平衡，但是当细胞代谢混乱时则起重要作用,例如炎症反应。细胞因子诱发敏感的细胞应答,如趋化作用、蛋白质合成和细胞分化等。初乳和乳中含有很多细胞因子，包括：白细胞介素(IL)1、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子和中性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子。很有可能这些因子在新生儿或婴幼儿调节免疫发育中起重要作用。同时和从乳中吸收的免疫球蛋白和非特异性的抗菌组分，例如：初乳中的乳过氧化物酶，联合起调节免疫的作用。,4、生长因子 之所以称之为生长因子是因为在鉴定这些因子的时候是基于其对各种各样的细胞系在体外刺激生长的作用。但是，实际上这些生物活性肽的分子基础和功能具有多样性。这些生长因子根据其发现的功能进行命名，所以他们的名字带有其发现历史的痕迹，但是显然有些不同的名称的生长因子其功能或分子结构却十分相似，甚至根本就是相同的。也有一些种类的因子，虽然生长因子之间非常相似但是实际上却是不同的。例如人的初乳当中的EGF和牛初乳相比具有非常高的浓度，而胰岛素样生长因子(IGF)I和II则实际上恰恰相反。初乳中几种主要的生长因子的详细情况讨论如下。,5、表皮生长因子受体配基家族 这一组多肽通常都可以和EGF受体结合(也就是c-erb1受体),包括 EGF本身、TGF-、乳腺来源的生长因子II(MDGF-II)、和人类乳生长因子III(HMGF-III),这种因子可能和EGF相同。其他具有这种结合特性的相关多肽在初乳里浓度很低，没有达到生理活性的浓度,这些生长因子是：双调蛋白（amphiregulin）,神经调节素（betacellulin）,和肝磷脂结合表皮生长因子（heparin-binding EGF）。,6、表皮生长因子 表皮生长因子（EGF）是由53个氨基酸残基组成的多肽，成年人是在唾液腺和十二指肠的勃氏腺（Brunners glands）分泌的。人初乳的EGF为200 g/L，常乳中为3050 g/L，同时在很多其他哺乳动物乳中也含有，但是牛乳中则没有达到有意义的含量。运用早产儿的胃液进行体外试验表明乳源EGF在典型的胃蛋白酶水解条件下不失活。与此相对照，成年人的胃液消化EGF153 则可以使之成为EGF149，其生物活性仅剩下原来的25%。一旦EGF进入小肠,在进食的条件下，就会变得对蛋白酶水解非常敏感，但是如果有进食的蛋白类食物存在可以有效地保护它不被水解。,关于EGF在正常情况下（未受损伤）对肠胃作用的生理功能还有争议。多数研究结果显示EGF受体在正常成人的肠胃道中，只存在于侧壁膜的细胞上，而不是顶部细胞表面。然而，EGF受体的分布在不同的生物中可能变化很大，例如,放射自显影研究表明，在猪的肠道顶部表面是有受体存在的。如果EGF的受体只分布于正常成年人的肠道侧壁膜上,那么，EGF在肠道内腔似乎不大可能发挥任何生物学作用。支持EGF有这种作用的证据是发现小鼠摘除唾液腺后不会发展成为自发性内脏溃疡或萎缩。然而，与对照动物相比，它们会因为缺少了修复系统而导致人工诱发的溃疡。所以科学家认为EGF起“内脏伤害监视肽”的作用。的确，EGF对这些部位的损伤有修复作用。但是，重要的是我们必须注意到，EGF可能进入不成熟的内脏和其侧壁细胞的受体结合，因为其通透性增加了。初乳和乳中的EGF因此可能在新生儿体内抑制细菌转移和刺激内脏生长、发育方面具有重要作用。,6、转化生长因子,转化生长因子（TGF-）是一种存在于人初乳和常乳中，较EGF浓度低（2.27.2 g/L）的50个氨基酸残基组成的多肽分子。和EGF相比,TGF-在整个胃肠道系统的粘膜内产生。TGF-的系统作用是刺激肠胃道生长与修复,抑制酸分泌，刺激损伤之后的粘膜恢复,和增加胃粘液素（mucin）的浓度。在小肠和结肠内,TGF-表达主要发生在小肠上段(非增生型区段),这表明其生理作用可能是影响分化和细胞迁移，而不是细胞的增生。因此TGF-可能对TGF-起互补作用，以控制肠内上皮细胞分化和增值之间的平衡。在部分肝切除术病人的胃肠粘膜损伤部位可以测定到TGF-表达的上调，这一实验结果支持TGF-在粘膜生长和修复中的作用。对这一作用进一步的证据来自在小白鼠中通过同源重组将TGF-“敲除”的研究。在对照条件下，这些小鼠具有相对正常的表现型，但是，增加了对结肠损伤的敏感性,虽然对小肠损伤并不敏感。这些发现支持TGF-在保持上皮连续性中的作用。换言之，多数研究表明TGF-的主要生理作用是在未受伤的粘膜系统中保持粘膜完整性和正常的上皮功能。,7、转化生长因子家族 该家族在分子上是和TGF-有区别的,而且在多数系统中实际上是起抑制细胞增值的作用。其异构性和TGF-相比，其主要表达部位是在正常的肠胃道的浅表部位,它们在这些区域抑制一旦离开肠腺区细胞的增值。TGF-具有很多功能，这种细胞因子对噬中性粒细胞具有趋化作用，刺激受伤部位表皮细胞的迁移。因此，似乎其主要作用是限制细胞的增值，在早期阶段，这些因子主要是修复损伤部位，然后促使细胞向表皮粘膜剥落的区域移动和生长，再造其连续性。TGF-和TGF-样分子在牛奶和牛初乳含量很高分别为12 mg/L和2040 mg/L。这样的浓度足可以防止消炎痛诱导的小鼠胃损伤。表明初乳中的TGF-可能在介导新生儿胃肠道保持完整性方面起重要作用。自从这些已经被证明是以TGF-1和TGF-2但以2的形式为主（85%）混合物的形式存在之后，TGF-样乳生长因子已经揭示出和牛乳酪蛋白组分有联系。,8、胰岛素样生长因子及其结合蛋白 胰岛素样生长因子IGF-I和IGF-II促进细胞增值和分化。它们在结构上相似于胰岛素原（proinsulin），在高浓度时起胰岛素样作用。肝脏是IGF主要的合成位点，IGF-I和IGF-II也在人类发育的胎胃和小肠中高浓度表达,在出生后迅速达到最大值。牛初乳含有比常乳高很多的IGF-I浓度(500g/L)。但是在常乳中则很低，只有10 g/L。这些生长因子在酸性和热条件下相对稳定。所以这些生长因子在一般的条件下保存表现比较好，在商业加工和胃酸的条件下能保持其生物活性。已知IGF-I是促进蛋白增加的，例如它是一种合成代谢因子，至少部分负责介导生长激素(GH)的促生长作用。存在于牛乳或牛初乳中的IGF-II比IGF-I要低很多,但是和IGF-I相似,它具有合成代谢活性并显示出减少饥饿动物的分解代谢的作用。,在牛或人初乳中的IGFs 或是以自由的或是以结合的两种形式存在。自由IGF的量在预产期是变化的，牛初乳中的IGF-I多数是以自由的形式存在的(不与其结合蛋白结合),相反地，在分娩前或常乳中则主要是结合形式。已经鉴定和克隆的IGF结合蛋白(IGFBPs)有六种。开始认为IGFBPs 的主要功能是作为蛋白载体减少的蛋白酶对IGF的消化，减少其生物活性，因为人们一直认为只有自由形式的IGF才具有促进细胞增值的活性。但是最近的研究表明，IGFBPs还具有另外的功能，因为已经证实不同的IGFBPs在不同的组织中的分布模式是不一样的，其浓度对于营养状态的反应也是变化的。例如，已经发现地塞米松对小鼠肝脏中IGFBP-1产物的增加作用,而对于营养不良的新生鼠则减少血清中的IGF-I和IGF-II，但是血清中的IGFBP-2增加。IGFBPs的详细功能尚不清楚，虽然其可能的作用之一是分泌或溶解的IGFBP通过限制游离形式的IGF结合到它的受体上来抑制IGF-介导的细胞增殖和氨基酸吸收作用。相反地，细胞表面或细胞介质相关联的IGFBPs可能会通过增加IGF-I、IGF-II和它们的受体的局部浓度来增加IGF的活性。,9、来源于血小板的生长因子 来源于血小板的生长因子(PDGF)是一种酸稳定的分子，最初鉴定的PDGF来源于血小板,但是后来发现巨噬细胞也合成和分泌这种因子。这种因子是由二硫健连接的两条多肽链构成，A 链(14 kDa)和B链(17 kDa)。因此该二聚体以三种异聚体的形式存在：AA,AB,和BB)，该生物活性因子与酪氨酸激酶型受体结合。PDGF是一种纤维原细胞和动脉平滑肌细胞的重要的有丝分裂原，PDGF的体外作用已经显示出通过动物进食促进溃疡的康复。虽然PDGF存在于人和牛初乳和常乳中，但是牛乳中PDGF-样促有丝分裂活性实际上来自牛初乳生长因子,该因子和PDGF 具有序列上的同源性。,10、血管内皮细胞生长因子 血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种同源二聚体3442-kD的肝磷脂结合糖蛋白，和血小板生长因子PDGF有关，具有很强的血管新生,促有丝分裂和血管通透性的增强作用。VEGF存在于人乳中，在哺乳第一周其浓度为75 g/L，第二周降到25 g/L。VEGF的特异性受体已经鉴定，分布在人类结肠细胞系Caco-2顶膜上。人类H-4细胞系也存在。虽然VEGF结合到这些细胞系上，但是它并不诱导增值响应。VEGF的生理作用并不清楚,虽然其新生血管活性在治疗消化道溃疡这样的疾病方面可能具有重要作用。,11、乳铁蛋白 乳铁蛋白（Lactoferrin）是一种铁结合糖蛋白，分子量为80 kDa，存在于人初乳中，浓度约为7 g/L,常乳中很低只有约1 g/L。牛初乳中也含有乳铁蛋白，但是含量只有人乳的10%。乳铁蛋白有多种生物功能，包括：促进铁吸收，抗微生物作用，调节免疫功能等。而且，乳铁蛋白已经显示出在体外能够促进各种细胞系的增值的作用,包括：纤维原细胞和小肠上皮细胞等,这表明乳铁蛋白在奶中可能对于新生儿的肠道发育和调节也具有重要作用。,12、生长激素及其释放因子 生长激素（Growth hormone，GH）,连同其释放因子(GHRF)和结合蛋白,存在于人和牛初乳和常乳中。报道的人初乳中GHRF浓度约41 ng/L,在常乳中则降到23 g/L。哺乳期婴儿具有很高的循环GH浓度，这大概是由于摄取GH之后它们刺激脑垂体进一步释放GH的结果。GH的生长促进作用是由IGF-I的释放介导的,虽然GH也有直接的促有丝分裂作用。非常有趣的证据是：系统的GH在肠道的生长和功能中起非常重要的调节作用。已有报道指出，GH受体存在于小鼠和转基因鼠的整个胃肠道系统62,转基因老鼠 GH的过量表达使其体重远远大于对照。然而，GH在内腔中的重要性仍然不清楚。也不知道GH受体是否存在于细胞膜的顶部。进一步的研究应该监测乳及初乳中GH的生理作用。,13、初乳中增强免疫作用的生物活性因子 初乳中除含有各种生长因子外，还含有其他各种生物功能的多肽或短肽。其中最为引人注目的是具有增强免疫作用的生物活性肽，如乳铁蛋白，乳铁素和免疫球蛋白。这些免疫球蛋白对于婴幼儿的免疫、抗菌、抗病毒、促进婴幼儿免疫系统发育具有极其重要的作用。,表2.3 初乳和常乳免疫球蛋白比较C.J.Hammer et al.(2004),另外实验还证明，初乳中高浓度的IgA、IgG1和IgG2、乳铁蛋白和溶菌酶对改善心血管功能也具有很好的作用。近年来的试验表明，食用动物乳的抗体后，其主要的抗体并不被肠胃中的蛋白酶所消化，大部分可以保持到小肠末端还具有生物活性。可见奶中抗体的主要功能不是为后代提供营养物质，而是抗菌和免疫功能。,14、唾液酸寡醣(Sialyloligosaccharides)T.Nakamura et al.研究了初乳中存在的一种唾液酸寡醣(Sialyloligosaccharides)和唾液糖肽（sialylglycoconjugates），证明其具有重要的生物学功能。它可能是婴幼儿脑神经节苷脂来源，同时也是抗病毒和病原菌感染的重要组分。有几种酸性寡糖在牛和人的初乳中已经鉴定出来，并对人初乳中的这些寡糖类物质进行了广泛研究。而相对来说，牛初乳则研究很少。该项研究测定了牛初乳中三种唾液酸寡糖的浓度、及其在各秘奶期的变化情况。研究表明，这些寡糖类物质对病原微生物具有明显的抑制作用，同时具有促进免疫的作用，对于肠道中的有益菌群，如双岐杆菌则具有很好的促进生长的作用。这些特点说明这类寡糖物质可以用于功能性食品添加剂以及医药工业。,15、其它很少研究的多肽 牛和人初乳中含有系列其他生物活性肽，其结构和功能很少研究，这些肽包括：巨噬细胞源性生长因子(MDGF-I),是一种62-kDa多肽，已经显示出具有刺激乳腺细胞生长和增强胶原质产生的作用。HMGF-I 和-II,是一种酸性的多肽，其生物学作用很少研究。牛初乳生长因子,一种35-kDa 的分子，负责牛初乳的大部分促有丝分裂活性，从生物化学的角度来看，它相似于HMGF-可能就是一种血小板生长因子PDGF。另一种牛MDGFs,如b-MDGF-I,其分子量约30kDa,显示出EGF-样活性,b-MDGF-II的分子量大于b-MDGF-I,大约50150 kDa。还有一些其他多肽的报道，但是后来发现其和已有的多肽相同，也有一些尚未阐明。但是显然，过去几年发现了众多的生物活性肽，而且预计在初乳和乳中还会发现更多具有临床意义的生物活性肽,初乳生物活性物质的分离,由于乳中，尤其是初乳中含有各种重要的生物活性物质，而利用乳腺来生产各种转基因药物已经成为科学家们最关注的领域。所以如何把初乳或常乳中的这些生物活性因子分离和纯化出来，特别是适合产业化的分离技术是近年来的热门课题。Elfstrand L et.al.（2002）利用超滤法建立了从初乳中分离胰岛素样生长因子的工艺，这无疑为大量制备该生长因子奠定了基础。,图1.膜过滤系统(PilotPlant ALP),表2.4 经过浓缩和纯化后的主要成分IGF和微量成分表,注：IGF：胰岛素样生长因子；UTP：均衡跨膜压；TP：真蛋白；TN：总氮；NPN：非蛋白氮；NCN：非酪蛋白氮。,该操作方法是基于UTP-超滤膜温度和压力控制操作，结合酸和热凝聚蛋白技术。牛初乳中的IGF主要是IGF-1。IGF-1和IGF-2两者都是分子量约为7.6 kDa的单肽链。IGF-1通常在体液中和其结合蛋白结合在一起。在牛初乳中也可以测定到这种结合。由于IGF-1是酸稳定的，而且有碱性氨基酸结合其上，所以在低于pH 6.4时，我们就可以通过酸化将其转化为游离肽的形式。而且，IGF-1在加热到75-82C，45秒钟是不会变性的。有必要进行30-40C酸化pH=5.0处理，以便在两个小时的分离过程中更好地把IGF-1和其结合蛋白分离开。第一个超滤步骤是应用TETRA 超滤系统(先用100 kDa超滤膜去除酪蛋白、免疫球蛋白和一些乳清蛋白。残留的蛋白通过酸处理和加热处理去除。凝固的蛋白通过另外的0,1 m过滤膜去除，第三步是应用3 kDa 超滤膜除去低分子量的化合物，如乳糖、矿物质、和大量水分，最后的到粗提的IGF浓缩物。,从牛初乳中分离乳铁蛋白的方法，吸引了很多人的研究。乳铁蛋白是富含于初乳中的一种功能因子，具有免疫调节、增强铁的传递和吸收、促进肠道菌群的平衡、作为生长因子、广谱的抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等独特的生物学功能。,乳铁蛋白经胃蛋白酶水解可以制备乳铁素，乳铁蛋白和乳铁素作为功能性组分应用于食品和医疗行业，具有广阔的应用和开发前景。张东送等研究采用离子交换方法，结合超滤脱盐和冷冻干燥等工艺实现了从牛初乳中分离出乳铁蛋白，利用乳铁蛋白制备乳铁素，并对乳铁蛋白和乳铁素的抗菌活性、免疫活性进行了系统研究。结果表明：选用CM Sephadex C-50阳离子交换树脂，在4下缓慢搅拌交换12h，采用5%的NaCl溶液洗脱，可得纯度为60%-90%的乳铁蛋白（一步法洗脱纯度为65%。二步法洗脱纯度为90%）；酶解牛乳铁蛋白制备乳铁素的最佳酶解条件为，底物浓度5%(w/v)，酶与底物浓度比1:30(w/w)，酶解时间为60min；牛乳铁蛋白与溶菌酶联合作用能增强其抗菌效果。牛乳铁蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以及乳铁素对其的最小抑菌浓度分别为2mg/mL，1.6mg/mL，0.5mg/mL，0.4mg/mL。此外，他们还研究了不同碳源、氮源、无机盐、缓冲液、有机酸及不同的温度和pH值对牛乳铁蛋白和乳铁素抗菌活性的影响；牛乳铁蛋白及其酶解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响；添加乳铁蛋白对延长巴氏消毒奶贮藏时间的影响。,图2.不同分离方法所得乳铁蛋白电泳分析。如图所示，样品1的纯度在90%以上，说明该方法分离效果比较理想。,几种生物活性因子的应用,1、肠胃科临床应用 食道炎（Esophagitis）和幽门相关疾病（pylorirelated disease.初乳，乳及其重组的生物活性肽显示出重要的临床应用价值，尤其是在逆流性食道炎或幽门螺旋菌诱导的消化器官溃疡方面。这是因为酸抑制性治疗，特别是质子泵抑制剂，和重组肽相比是很有效很便宜的。而且，标准的幽门疾病通常由质子泵抑制剂和抗生素治疗7天即可根除，成功率达到90%以上。而由幽门螺旋菌诱发的胃溃疡则是终身的。而且很多的肠胃疾病的病理学都需要寻求新的治疗方法。这些疾病讨论如下。,短肠综合症（Short-bowel syndrome）有些患者肠道消化和吸收食品不充分，或没有足够的有效时间，这通常是由于肠切除术或炎症性肠病重复手术的结果。通用的治疗方法是讨厌的，复发率和死亡率都很高的,例如,长时间的静脉注射药物或吃药，以及小肠移植。解决这个问题的最好的办法就是不经肠胃来输入全部营养。有证据表明生长因子可以达到改善营养吸收的目的，例如EGF 已经显示出刺激小鼠肠道生长吸收全部营养的作用。而且，口服EGF也可以帮助空肠切除以后的家兔肠道恢复葡萄糖转运和根皮苷的结合。给小猪喂养初乳可以显著增加其肠道细胞增值。追加初乳特别是对于肠道切除术的小孩具有特殊的价值,因为肠道的适应小孩和成年人相比更容易恢复。,非甾体类抗炎药引起的肠道损伤非甾体类抗炎药（Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）得到了广泛的研究，并证明在骨骼、骨骼肌损伤和慢性关节炎的治疗方面有效。然而，大约有2%的患者服用NSAIDs一年会产生肠胃副作用,包括出血、穿孔和胃肠道狭窄。酸抑制剂和前列腺素类似物已经证明对于减少由NSAIDs造成的损伤具有明显的效果，但是，对于防止小肠损伤则基本上无效。处理这些问题的新的治疗方法是重组肽的应用仍然是非常必要的。最近的体内和体外研究支持这一观点。EGF、TGF-、和TGF-75都显示了减少NSAID-诱发的胃损伤。但是，重组生长因子对于NSAID诱导小肠和大肠损伤的有益的作用都不能得到很好的证实。新的研究还表明，脱脂初乳富含生长因子制备物如前面所介绍的，可以减少NSAID诱导的小鼠和大鼠的胃和肠道损伤(图3)。该项研究也显示出对于减少由于服用NSAIDs所造成的胃糜烂。进一步的证据来自近来所做的研究，脱脂初乳富含生长因子的制备物可以减少小肠的通透性，该研究是通过服用一定计量的消炎痛造成小肠损伤的志愿者做出的。有关的临床试验正在进行中。,图3.牛初乳、消炎痛或两者对非甾体类抗炎药诱导产生的大鼠小肠损伤的作用。小鼠在饮水14天之后服用初乳和安慰剂，在处死之前24小时，有些动物也接受85mg的消炎痛/kg皮下注射。显微解剖测定了小肠绒毛的形态(放大倍数为：200)。从左向右：左端为对照，没有服用消炎痛或初乳，其绒毛很长，尖端稍细；中间的图片是仅接受消炎痛的老鼠，其绒毛变粗变短，顶端膨大；右侧：是接受消炎痛同时接受初乳的小白鼠，其绒毛没有显著的变化。,化疗引起的粘膜炎 对于癌症病人流行的疗法是需要患者服用大剂量的化疗制剂。结果，这些高剂量的毒性制剂会引起骨髓和胃肠道很大的副作用。结果限制了化疗的持续进行。显然，只要保护好这些组织免受损伤，即可以增加患者的治疗机会。例如：EGF可以增强由氨甲蝶呤(抗肿瘤药)造成的小鼠肠粘膜损伤的恢复。TGF-可以改善化疗引起的粘膜炎,食用干酪乳清粉制备物可以减少氨甲蝶呤所引起的大鼠肠道损伤。但是，并不是所有的研究都显示如此好的结果，因为有些病人EGF只对经过化疗的一期临床病人消除口角溃疡有明显的疗效。如果使用这些具有生长刺激作用或抑制作用的因子，使用时间可能是很关键的。生长抑制因子可能对于保护骨髓或肠道因化疗所引起的损伤具有一定的作用,但是这种因子可能更适合于化疗之前，而在化疗之后，则更适合于生长刺激因子的使用。后者已经用于临床，例如：集落刺激因子用于刺激骨髓在化疗以后的恢复。,炎症性肠病(IBD)溃疡性肠炎病和克隆氏病(Crohns Disease)的病因学是未知的，因此，其现行的治疗方法只是凭经验，没有很有效的治疗方法。关于EGF,PDGF,TGF-或 IGF-I对大肠炎症治疗效果的动物学模型研究已经取得了令人鼓舞的结果。干酪乳清生长因子提取物含有几种乳生长因子，在类似的动物模型中具有确切的治疗作用。乳原生物活性物质已经用于炎症性肠病的临床治疗，服用来自酪蛋白的生物活性物质治疗克隆氏病已经获得了预期效果。乳的制备物中含有巨噬细胞源性生长因子（MDGFs）,如果在加工乳蛋白的过程中保护其不被破坏，则用这种提取物做初乳灌肠剂，治疗溃疡性结肠炎和顽固性直肠炎取得了很好的效果。,坏死性小肠结肠炎(NEC)坏死性小肠结肠炎（NEC，Necrotizing enterocolitis）是一种严重的危机儿童生命的疾病,其症状是严重的小肠和大肠溃烂。虽然已经有一系列可能的风险因素与此有关，但是其病因学尚不清楚,这些因素包括：早熟、肠道感染、肠内缺血和超敏反应等。虽然很多前致炎分子（proinflammatory）似乎参与到NEC病因学中，但是最近，人们把注意力锁定在磷脂介导的血小板活性因子上(PAF),这种活性因子是由肠内菌群和炎症细胞在NEC发展期产生的。研究发现，人初乳中含有血小板活化因子-乙酰水解酶（PAF-acetylhydrolase,PAF-AH）,这就解释了为什么母乳喂养可以保护小孩抵御NEC的发展。虽然NEC的分子机理仍不清楚，但是毫无疑问，一旦得病，就可能有很高的死亡率。流行的治疗方法是抗生素、流体取代等，但是其治疗效果不佳，所以需要新的治疗方法,例如，刺激修复系统的肽的利用。支持这个观点的证据来自最近的一项研究。给患者持续地灌输EGF，结果NEC的患者获得了很好的治疗效果，见图4，正在进行进一步的临床试验。,图4.患有坏死性小肠结肠炎的小孩肠组织切片的苏木精和曙红染色(放大倍数：200)。左侧是治疗以前，右侧是用灌输表皮生长因子治疗7天以后。治疗以前，肠粘膜几乎完全溃烂，但是治疗以后肠粘膜几乎完全恢复。其详细的情况请参见文献。,传染性腹泻 多数传染性腹泻是可以自愈的。只有偶尔的需要使用抗生素治疗。对于免疫有缺陷的病人，例如HIV感染者他们对病原菌感染就会变得非常敏感。例如：隐孢子虫（Cryptosporidium）感染。高免疫的乳（免疫乳）或初乳，就有利于预防或治疗这类疾病。预防各种细菌和病毒感染的免疫乳已经广泛用来进行人类和兽医治疗。例如抗轮状病毒的免疫乳等，通过服用免疫乳（初乳）而不是纯化的抗体已经取得了良好的治疗效果。另外，利用初乳中的生长因子等非特异性生物活性因子治疗某些疾病也取得了很好的进展。,总之，应用这些来源于初乳的生物活性肽或提取物治疗很多疑难病症已经取得了令人鼓舞的进展，尤其是肠胃道疾病。相信未来的十年，将一定会在乳、初乳和免疫乳方面取得更多的进展，尤其是在肠胃道疾病方面可能得到广泛应用。,2、牛初乳增强机体免疫力和抗菌抗病毒 分泌型IgA对于宿主抵抗某些病毒和传染是非常重要的。特别是产生上呼吸道感染的病毒(URTI)。分泌型IgA的含量比血清中的抗体对某些病毒的入侵更加有效，例如URTI。近来的研究表明，由于分泌型IgA主要在粘膜系统发挥抗感染作用，所以服用牛初乳可以激活机体粘膜系统抗感染的活性，而且，在运动员中服用牛初乳可以增加血液中的IGF-I和唾液中IgA的浓度,IGF-I 的增加对于蛋白质的合成具有正的调控作用,这也表明IGF-I对粘膜系统抗感染具有重要作用。因此，通过饮用牛初乳增加血液中IGF-I的研究引起了科学家们的极大兴趣。服用 125I-标记的牛初乳IGF-I也已经证明IGF-I可以进入血液循环。给小鼠服用牛初乳也能够促进小肠的生长。,存在于牛初乳中的另一种重要的生物活性物质是抗菌活性因子,包括：免疫球蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、和乳铁蛋白。牛初乳极富含免疫球蛋白，相当于常乳的100倍以上。这些在新生儿抵御病原微生物入侵和促进免疫和发育具有重要意义。对于免疫功能低下的病人、老人更具有广泛的应用前景。相信初乳的研究与开发顶将成为功能性食品和药品开发的热门领域，也一定会在提高人类健康，改善人类生理功能方面发挥越来越重要的作用。,第二节、免疫乳及免疫乳之谜,1、免疫乳概念 所谓免疫乳（Immune Milk）是指给哺乳动物（主要是指奶牛、奶山羊等）选择性地接种一些能够引起人或动物疾病的细菌、病毒等病原体，刺激机体发生免疫应答以分泌特异性的抗体和相应的免疫因子进入乳中，这种含有特异性抗体和免疫因子的乳即为免疫乳。2 免疫乳的发展史 早在1892年，德国科学家Ehrlieh就发表了关于母鼠的乳汁可使其幼仔获得对疾病抵御能力的报道，并首次使用了“免疫乳”（Immune milk）这一术语。1950年，美国明尼苏达大学著名的乳品科学家Petersen及其同事发现，位于牛乳房结缔组织乳状腺小泡的三角区(septa)含有抗体产生细胞，为研究免疫乳提供了理论依据。尽管免疫乳的发展历经百年，但真正进入实际开发应用阶段则是80年代后期，为首的是美国的Stolle，他成立了第一个生产免疫乳制品的公司，该公司下属的乳生物制品部(Milk Biologic Division)从1988年开始与新西兰乳品局合作在世界范围内开发、制造和销售免疫乳制品，生产的产品有免疫全脂乳粉、免疫脱脂乳粉、超滤高蛋白免疫乳粉、免疫乳清蛋白浓缩物等，目前已销于日本、台湾、马来西亚、泰国、香港等地。,3、免疫乳的作用 免疫乳是一种天然、健康、安全并具有一定疗效的新型功能性乳制品，将其用于人体的保健及对一些疾病的预防和治疗具有许多优点。通过试验，业已证实不同的免疫乳具有如下功能。a对关节炎患者，特别是类风湿关节炎患者。饮用特定的免疫乳可缓解肿胀、疼痛，改善关节的运动性及患者的精神状态。b可预防由轮状病毒和大肠杆菌引起的腹泻。c预防霍乱的发生及中和其毒素。d具有抗隐性孢子虫作用。e预防龋齿及牙周炎等口腔疾病的发生。f改善肺功能，减少吸烟危害。g改善心血管功能，消除主动脉壁上脂肪的沉积和血栓的形成。h抗破伤风毒素。i对高脂血症患者具有降血脂功能。j免疫乳中抗炎症因子的抗感染及抗炎症作用。i.调整肠道微生态环境，清除肠道中病原菌和腐败菌及其所产生的毒素，从而调整整个机体的健康。,4、免疫乳的作用机理 根据免疫应答的特异性，针对不同的疾病运用引起该疾病的病原体或毒素作为抗原对奶牛进行系统免疫得到含有特异性抗体的免疫乳，当人饮用时可起到预防和治疗一些疾病的目的。经研究发现，免疫乳的这些功能主要基于以下理论。(1)、人体肠道存在局部的分泌性免疫机制。肠道的局部免疫系统被肠道中病原微生物刺激肠粘膜后可产生特异性的免疫球蛋白IgA以抵御病原微生物的感染、定植及增殖。这一肠道局部免疫机制对保持机体的健康具有重要的作用，但这一作用是有限的。当肠道的局部免疫系统失调时，肠道中的一些病原微生物就会在肠道中大量增殖，最后导致肠道疾病（如腹泻、肠炎等）以及非肠道疾病（如类风湿关节炎、急性外围关节炎等）的发生。研究表明，类风湿性关节炎与肠道中一些微生物的增殖密切相关。,(2)、对牛进行选择性免疫可获得具有特异性的抗体。不同的免疫方法会导致乳中不同的免疫球蛋白占优势。对牛进行局部免疫（如乳房内接种）所产生的乳中，IgA占优势；而系统免疫（如肌肉内接种），则有利于lgG的产生。但由于IgG是牛乳中主要的免疫球蛋白，因此采用系统免疫方法可得到具有高滴度的抗体的免疫乳。尽管乳中的IgG不同于肠道局部免疫产生的IgA，但免疫可得到特异性的抗体，因而免疫乳中的特异性IgG同样具有一定的免疫功能。(3)、用免疫乳通过口服对人进行被动免疫，肠道无需吸收抗体就可起到免疫作用。乳中的免疫球蛋白只要到达肠道后仍具有活性，就可特异性中和并清除肠道中的致病菌，从而起到预防和治疗疾病的作用。同时，肠道中有害微生物的清除，还有利于有益微生物的存活与定植。事实上，以乳作为载体，免疫球蛋白通过胃肠道时由于乳中的其它组分（特别是酪蛋白及其它乳清蛋白），可以“缓冲”或“淹没”其中的蛋白酶，从而使乳中的抗体免受其作用而保持其生物活性，同时，许多研究表明，即使是从乳中分离出来，其中的IgG在体外和体内对蛋白酶分解仍具有较高的抗性。(4)、免疫乳中的非抗体组分。尽管目前还不十分清楚免疫乳中的非抗体组分，但可以肯定，免疫乳中除特异性抗体外还有许多非抗体组分，如抗炎细胞因子，这些非抗体组分能发挥某些特殊的生理作用。,5、免疫乳的临床试验 在西方，牛初乳（Bo