食品微生物检验的指标.ppt

第四章 食品微生物检验的指标,一、菌落总数二、大肠菌群MPN三、致病性微生物四、霉菌与酵母菌数,第一节 细菌相与食品卫生的关系,1、细菌相：指存在于某一物质中的细菌种类及其相对数量的构成。食品中的各种细菌就构成了该食品的细菌相，水中的细菌构成了水的细菌相。细菌相是对细菌的种类面言，在菌相中相对数量较大的一种或几种细菌被称为优势菌。2、嗜冷菌：这类细菌在接近0时生长得比较好，最适温度为10一20，最高温度在30一35。3、嗜温菌：这类细菌都能在25气40迅速生长，在55不生长。4、嗜热菌：这类细菌生长范围为4375，最适为50C一55C，在32C以下很难生长。嗜温菌和嗜热菌的一些细菌在生长温度范围上有重迭，产生芽胞的细菌尤其如此。,一、细菌相对食品卫生质量的影响,1、新鲜畜禽肉的细菌相：主要是嗜温菌，包括大肠菌群、肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙门氏菌等。新鲜肉类的细菌相以嗜温菌为主，在温度适宜时，嗜温菌会大量繁殖造成肉的变质，同时发生臭味；在冷藏条件下，嗜温菌生长很慢甚至不生长，嗜冷菌开始大量繁殖，逐渐成为优势菌，最后会导致肉表面形成粘液并产生气味；在冷冻条件下，所有的细菌都不再生长繁殖，因而可以较长期保存而不变质。,2、液体蛋晶的细菌相：主要是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属等。3、鲜鱼的细菌相以嗜冷菌为主，有假单胞菌属、黄色杆菌属和弧菌属等。如在水产品中发现了沙门氏菌，一般认为是外来污染，应对该产品的生产，加工过程进行分析、检测，从而找到污染源。,二、食品的正常菌相和细菌数量,食品及原料都有正常的细菌相，它们因受多种因素的影响，其种类和数量有很大差别。1、鲜肉的细菌相以嗜温菌为主，其次为嗜冷菌。加工良好的鲜肉细菌数为103个g左右，如加工不良会达到106个g，肉制品的细菌数约为103104个g，大肠菌群MPN为10102个100g，金黄色葡萄球菌为10-102个g。2、鲜蛋的细菌相以革兰氏阳性球菌为主，革兰氏阴性杆菌数量很少。3、液体蛋晶的细菌相是革兰氏阴性菌，包括假单胞菌属、产碱杆菌属、变形菌属和埃希氏菌属，细菌数量一般为104106个g，大肠菌群为103105个100g，沙门氏菌为1100个g。,由于食品菌相及其优势种不同，食品的腐败变质也具有相应的特征。有些细菌能分解蛋白质或脂肪或碳水化合物，有些细菌则能使食品产生色素和发光，有的还可以使食品变粘等。,第二节 菌落总数（GB/T4789.2-2008）,一、菌落总数的概念及卫生意义 1、菌落总数 食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g）检样中形成菌落的总数。,按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养48h，能在 平板计数 琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。,2、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL或1cm2样品中的细菌总数来表示。,3 菌落总数在食品卫生质量评价中的意义,1）食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度 新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有所不同。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。相反，食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。,2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间 一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，食品耐放时间就越短，例如用O保存牛肉，菌落总数为103cfucm2时，可保存18天，而当菌落总数增至lO5cfucm2时则只能保存7天。另外，用0保存鱼时，菌落总数为105cfucm2时可保存6天而菌落总数在103cfucm2时则可保存12天。,3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况 一般认为日常食品的活菌数为104107cfug。而当活菌数达到108cfug则可认为处于初期腐败阶段。例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到1.5103cfucm2。而加工后马上检测可达3.5104cfucm2。当菌落数为107cfu/cm2时表示确已经腐败，鸡肉的细菌数达108cfucm2时可有气味并变粘。一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败变质过程的进程，甚至可能引起食用者的不良反应。,二、菌落总数的常规检验方法,菌落总数的常规检验方法(GB47892-2008)：基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养48（24）小时计数报告。,（一）样品的处理和稀释：,1操作方法：1）、以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。2）、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。3）、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。,2无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。,3采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,（二）倾注培养,1操作方法：1）、根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。2）将凉至46平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。3）待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。,2倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,4培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。5为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培养基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。,（三）计数和报告,1操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。,2到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,3.稀释度选择及菌落数报告方式,1）.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。2）.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l）计算：N=C/（n1+0.1n2）d（1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n 1第一个适宜稀释度接种平板个数n2第二个适宜稀释度接种平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。,3）.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4）.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5）.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6）.若所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,菌落总数的报告,1）.菌落数在100以内时，按“四舍五人”原则修约，采用两位有效数字报告。2）.大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3）.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4）.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5）.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,（四）特别注意,1 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,2当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,3当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,（五）其他方法,1、菌落总数PetrifilmTM测试片法（标准方法）2、涂布平板法 3、点滴平板法 与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法一样移入温箱中，培养68小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0025m1换算为1ml)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。,第三节 大肠菌群MPN一、大肠菌群MPN的概念及意义,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。1、概念：大肠菌群系指一群在36条件下能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等以埃希氏菌属为主，大肠菌群MPN（most probable number,MPN）是指在1ml(或1g)食品检样中听含的大肠菌群的最近似或最可能数。,2、作为（判断食品是否被肠道致病菌所污染及污染程度的）指示菌的条件：和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。检验方法比较简便。,3大肠菌群的食品卫生学意义,1）大肠菌群可作为粪便污染食品的指标菌；大肠菌群主要来源于人及温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。微量粪便污染不可能以化学方法检查出来，在食品中大肠菌群的存在即使少量也很容易而且准确的被检出。2）大肠菌群可作为肠道致病菌污染食品的指标菌,4、大肠菌群数量的表示方法有两种,1）大肠菌群MPN大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值；2）大肠菌群值。大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用。,二、大肠菌群MPN的常规检验方法(GB47893-2008),1.大肠菌群MPN计数法 常规检验方法。将不同倍数的检样稀释液接种到LST肉汤管内，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性；如有产气者，则需进行证实试验，然后查取MPN检索表，报告出每1mL(或1g)大肠菌群的最可能数。大肠菌群MPN的检验程序如下：,三、操作步骤,()检样稀释1以无菌操作将检样25克(或25毫升)放于含有225毫升灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成110的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以800010000r分钟的速度处理1分钟作成110的均匀稀释液2用1毫升灭菌吸管吸取110稀释液1毫升，注入含有9毫升灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成l100的稀释液。3另取1毫升灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释次，换用支1毫升灭菌吸管。4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。,(二)初发酵试验将待检样品接种于LST肉汤管内，接种量在1毫升以上者，用双料LST肉汤管；1毫升及1毫升以下者，用单料LST肉汤管，每一稀释度接种3管，置36士1温箱内，培养48士2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。,(三)复发酵试验用接种环从所有产气管分别取培养物1环接种煌绿乳糖胆盐肉汤管（BGLB），置36士l温箱培养48士2小时，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。(四)报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检素表，报告每1毫升(克)大肠菌群的最可能数。,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,三、大肠菌群MPN的其它检验方法,大肠菌群MPN的其他测定方法有大肠菌群平板计数法、大肠菌群PetrifilmTM测试片法。大肠菌群平板计数法检验程序,操作步骤,（一）样品的稀释按“四”操作步骤“（一）”进行。（二）平板计数1.选取23个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1 mL。同时分别取1 mL生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。2.及时将1520 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加34 mL VRBA（结晶紫中性红胆盐琼脂）覆盖平板表层。翻转平板，置于36l 培养1824 h。,（三）平板菌落数的选择选取菌落数在30150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。,（四）证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361 培养2448 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。（五）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以“七”操作步骤“（三）”平板菌落的选择中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。,第四节 致病性微生物,一、食品中常见的致病性微生物 食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品为例）1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。,二、致病菌的食品卫生学意义,“中华人民共和国食品卫生标准”规定，任何食品都不得检出致病菌，即食品中均不能有致病菌存在，这是一项非常重要的食品卫生质量指标，是绝对不能缺少的项目。食品中致病菌的存在所引起的对人类健康的危险，已不再是推测性和潜在性的，而是肯定性和直接的。由于食品种类繁多，加工贮藏条件各异，加之致病菌种类也很繁多，不能用少数几种方法将多种致病菌全部检出，而且在绝大多数情况下，污染食品的致病菌数量不多，所以在食品中致病菌的检验，不可能将所有病原菌都作为重点检验，只能根据不同食品的特点，选定某个种类或某些种类致病菌作为检验的重点对象。如蛋类、禽类、肉类食品以沙门氏菌检验为主；罐头制品以肉毒梭菌、肉毒毒素为主，牛乳以结核杆菌和布氏杆菌为主。在不同情况下，还根据需要有重点地增加一定的致病菌检验项目。,三、致病性微生物的检验,按照国家统一的方法进行检验 注意：在加工食品中能够存活下来的致病性微生物往往受到了某种程度的损伤，它们会受到增菌液中抑制剂的影响而不能被检测出来。因此，需要进行前增菌，以帮助致病菌恢复到正常状态。前增菌的适宜方法和使用的培养基则因食品的理化性质、加工方法不同而异。,第五节、霉菌和酵母菌数,一、食品中霉菌和酵母菌数的概念：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，经计数所得1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数(粮食样品则指1g粮食表面的霉菌总数)。,二、霉菌和酵母菌数的食品卫生学意义 霉菌和酵母菌也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌数作为判定食品被霉菌和酵母菌污染程度的标志，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。目前已有若干国家制订了某些食品的霉菌和酵母数的限量标准。,三、测定及表示方法,食品中霉菌和酵母含量多少的测定，我国食品卫生微生物学检验标准规定采用平板培养菌落计数法，培养基必须选择具有抑制细菌作用的选择性培养基。培养的温度一般为2528，培养时间为35天。通常以每克(或每毫升)食品所含霉菌和酵母数以cfug或cfumL表示。,