食品中毒性微生物的检验.ppt

第四章 食品中毒性微生物的检验,第一节 食物中毒概述 第二节 沙门氏菌及其检验第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验 第四节 变形杆菌类及其检验第五节 志贺氏菌及其检验 第六节 葡萄球菌及其检验第七节 链球菌及其检验 第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验 第十节 平酸菌及其检验第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检验,第一节 食物中毒概述,一、食物中毒的概念和分类（一）概念食源性疾病：指通过摄食进入人体内的各种治病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。食物中毒：指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。,（二）、食物中毒的分类,一般按病原物质，将食物中毒分为五类。1细菌性食物中毒 是指摄人含有细菌或细菌毒素的食品而引起的食物中毒。2真菌及其毒素食物中毒 是指摄人被真菌及其毒素污染的食物而引起的食物中毒3动物性食物中毒 是指摄人动物性中毒食品而引起的食物中毒。4有毒植物中毒 是指摄人植物性中毒食品引起的食物中毒。5化学性食物中毒 是指摄人化学性中毒食品引起的食物中毒。,（三）食物中毒的特点,食物中毒常呈集体性爆发，其种类很多，病因也很复杂，一般具有下列共同特点：1潜伏期较短，来势急剧，在短时间内可能有很多人同时发病。2病人都有大致相同的临床表现。3发病和吃某种有毒食品有关。凡进食这种有毒食品的人大都发病，没有进食该种有毒食品的人不发病。发病和食物有明显关系，一旦停止食用这种有毒食品，发病立即停止。4发病率高，人与人之间不直接传染。一般没有传染病流行时的余波。,二、细菌性食物中毒,1、概念细菌性食物中毒是指由于食入被病原菌或其有毒代谢产物污染的食物后，所引起的以急性肠胃炎为主要中毒症状的疾病。是食物中毒事例中最为常见的一类，通常有明显的季节性，多发生于气候炎热的季节，一般以510月份最多。发病率较高，但病死率一般较低。,2、特点诱发的食物主要为动物性食品，如肉、鱼、奶、蛋类等及其制品；植物性食物，如剩饭、糯米凉糕、豆制品等。其共同的临床表现为：潜伏期短、来势急剧、食用者集体发病且发病率高，发烧、呕吐、腹痛腹泻等急性胃肠炎症状，但无传染性，只与食物有关。,3、分类,第一类，感染型食物中毒，是指人体食入含有大量活的病菌(一般含菌数在107个g以上)的食物后，引起消化道感染而造成的中毒，有上述典型的临床表现，又称胃肠型食物中毒。引起此类中毒型的细菌，常见的有：沙门氏菌属、副溶血性弧菌、变形杆菌、致病性大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、魏氏梭菌及金黄色葡萄球菌等。,发病机制：病原菌随食物进入肠道，在肠道内继续生长繁殖，靠其侵袭力附于肠黏膜或侵入黏膜及黏膜下层，引起肠黏膜充血、白细胞浸润、水肿、渗出等炎性病理变化。某些病原菌如沙门氏菌进入黏膜固有层后可被吞噬细胞吞噬或杀灭，病原菌菌体裂解后释放出电解质，内毒素可作为致热源刺激体温调节中枢引起体温升高，亦可协同致病菌作用于肠黏膜，引起腹泻等胃肠道症状。,临床特征 1）潜伏期短，一般几小时到24小时，平均为12小时左右，潜伏期长短主要与进入机体的细菌量及个体体质状况有关。2）病程短，通常为13天，个别细菌可长达714天，如沙门氏菌37天、小肠结肠炎耶尔森氏菌为314天，溶血性链球菌为27天等。3）发病症状以急性胃肠炎为主。表现为恶心、呕吐、腹泻，体温升高、头痛等。从病人和原因食品中均可分离出相同的病原微生物。,第二类，毒素型食物中毒，是指人体食入了含有细菌毒素的食物后所引起的中毒，既使无活菌随食物侵入人体仍可能发生中毒。它能引起眼肌、咽部肌肉麻痹，重者可影响颅神经乃至死亡，故又称神经型食物中毒。细菌的毒素可分为肠毒素及外毒素两种。,临床特征 1）潜伏期长短不一，如金黄色葡萄球菌肠毒素所引起的中毒潜伏期为25小时；肉毒素中毒潜伏期2小时到10天，甚至10天以上。2）病程长短不一，如金黄色葡萄球菌毒素中毒能够迅速痊愈，而肉毒毒素中毒则恢复很慢，一般为23天，长的达23周。,3）胃肠型症状不明显如葡萄球菌肠毒素所引起的中毒虽有频繁的呕吐、腹痛，但腹泻很少见，体温正常或微升高。肉霉毒素所引起的中毒，虽然初期表现为恶心、呕吐，有时有腹泻，但其主要症状为痉挛 交感神经失调、分泌机能失调等神经症状和虚脱，出现不能抬头、瞳孔放大、光反应迟钝，言语困难、吞咽不易、呼吸不畅等。,第三类 混合型食物中毒 既具有甚染型食物中毒的特征，又具有毒素型食物中毒的特征，称为混合型食物中毒。如魏氏梭菌、蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。这种中毒在检验时，应特别重视对其毒素的测定。副溶血性弧菌等病原菌，进入肠道除侵入黏膜引起肠黏膜的炎性反应外，还可以产生肠毒素引起急性胃肠道症状。这类病原菌引起的食物中毒是致病菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用，因此，其发病机制为混合型。,三 真菌性食物中毒,（一）、霉菌产毒的特点1.具有相对性 霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌，而产毒菌种中也只有一部分菌株产毒。产毒菌株的产毒能力还表现出可变性和易变性 2.不具有一定的严格性 即一种菌种或菌株可以产生几种不同的毒素，而同一种霉菌毒素也会由几种霉菌产生。3.要具备一定的环境条件,（二）、主要产毒霉菌,已知的产毒菌现有以下一些属种：1曲霉属（Aspergillus）曲霉在自然界分布极为广泛，对有机质分解能力很强。曲霉属中有些种如黑曲霉（A.niger）等被广泛用于食品工业。同时，曲霉也是重要的食品污染霉菌，可导致食品发生腐败变质，有些种还产生毒素。曲霉属中可产生毒素的种有黄曲霉（A.flavus，其毒素剧毒物，毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍）、赫曲霉（A.ochraceus）、杂色曲霉（A.versicolor）、烟曲霉、构巢曲霉（A.nidulans）和寄生曲霉（A.parasiticus）等。,2青霉属（Penicillium）青霉分布广泛，种类很多，经常存在于土壤和粮食及果蔬上。有些种具有很高的经济价值，能产生多种酶及有机酸。另一方面，青霉可引起水果、蔬菜、谷物及食品的腐败变质，有些种及菌株同时还可产生毒素。例如，岛青霉（P.islandicum）、桔青霉（P.citrinum）、黄绿青霉（P.citreo-viride）、红色青霉（P.rubrum）、扩展青霉（P.expansum）、圆弧青霉、纯绿青霉、展开青霉（P.patulum）、斜卧青霉（P.decumbens）等。,3镰刀菌属（Fusarium）镰刀菌属包括的种很多，其中大部分是植物的病原菌，并能产生毒素。如禾谷镰刀菌（F.graminearum）、三线镰刀菌（F.trincintum）、玉米赤霉、梨孢镰刀菌（F.poae）、无孢镰刀菌、雪腐镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌（F.sparotrichioides）、木贼镰刀菌、茄属镰刀菌、粉红镰刀菌等。,4交链孢霉属（Alternaria）菌丝有横隔，匍匐生长，分生孢子梗较短，单生或成丛，大多不分枝。分生孢子梗顶端生长分生孢子，其形状大小不定，形态为桑椹状，也有椭圆形和卵圆形，其上有纵横隔膜、顶端延长成喙状，多细胞。孢子褐色，常数个连接成链。尚未发现有性世代。交链孢霉广泛分布于土壤和空气中，有些是植物病原菌，可引起果蔬的腐败变质，产生毒素。5其他菌属 粉红单端孢霉、木霉属、漆斑菌属、黑色葡萄穗霉等。,（三）几种常见真菌性食物中毒特征,四、引起微生物性食物中毒的原因,1食品原料受到了污染 2生产、加工、运输、销售及食用过程中的污染 3加工方法不当 主要是某些大块食品在烧煮时时间太短或温度太低，不能足以杀死微生物，或油炸食品时中心未熟透等。4交叉污染 在食品制作时，发生了生熟食品交叉污染，如用盛放过生食品的容器、用具、刀板等与熟食品发生接触，而导致生食品中的某些微生物污染到熟食品上，这种熟品在食用前没有经过再加热或加热温度不足以杀灭污染的微生物。5工作人员的污染 接触食品的工作人员的个人卫生状况不良，如患有某种肠道传染病或带菌，则可以将这种病原微生物污染到食品上而导致食物中毒或食物感染。,五、微生物性食物中毒的预防,微生物性食物中毒常常给人类带来严重的危害。是食品卫生检验的重要内容之一。1严格执行有关法规 严格遵守国家颁布中华人民共和国食品卫生法和其他有关的条例、规定，以及各地区制定的各种规定与卫生要求加强食品卫生的检验与监督工作。2严格防止食品污染 3控制微生物在食品上的繁殖 一般食物中毒性细菌的最适生长温度在35+37；绝大部分在低温下即停止繁殖或缓慢繁殖，因此，低温贮存食品是控制污染微生物在食品上繁殖的重要措施。4杀灭污染食品中的微生物 杀灭食品中微生物的方法很多，如降低食品pH值、提高食品的渗透压(盐腌、糖溃)、采用紫外线照射或其它辐射线照射和加热灭菌等；其中加热灭菌法对微生物的杀灭最为彻底，这在食品罐头生产中已广泛应用。5加强食品卫生检验和宣传工作,第二节 沙门氏菌及其检验 GB/T4789.4,在微生物分类学中，沙门氏菌属是肠杆菌科的一个大属，包括2000多个血清型，它们在形态结构、培养特性、生化特性和抗原构造方面都非常相似，是一类形态短小的革兰氏阴性杆菌，主要寄居于人和其它温血动物的肠道中，可引起多种性质的疾病，根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。,第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌，乙型副伤寒伤门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌。第二类群：能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌，此类群中尽管很少感染人，但近年也有感染人的报道。,、生物学性状,()、形态特征沙门氏菌属为革兰氏阴性小杆菌，长13微米，宽0.50.8微米，无芽孢，般无荚膜，周生鞭毛，能运动，多数有纤毛，能吸附于细胞表面或凝集豚鼠的红细胞。,(二)、培养特性需氧(或兼性压氧菌)，生长温度为1042，最适温度37，适宜pH6.87.8，对营养要求不高。在普通琼脂培养基上：37培养24小时后形成中等大小(23毫米)、园形或近似园形，表面光滑、湿润、边缘整齐、无色半透明的菌落。在远腾氏、中国兰、伊红美兰等培养基上因不发酵乳糖，菌落呈无色透明。在普通肉汤培养基中生长良好，呈均匀混浊，在胆盐（煌绿或亚硒酸盐)肉汤培养基中大肠杆菌被抑制，沙门氏菌生长良好，呈均匀混浊。,SS琼脂培养基上：37培养24小时后，由于这种培养基中含有胆盐、煌绿，可抑制大肠杆菌的生长，而沙门氏菌能够生长，且不分解乳糖，故菌落为圆形、光滑、无色透明直径为13毫米。,(三)、生化特性1 发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气；2 不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇；3 不产吲哚、V-P反应阴性；4 不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖；除鸡白痢沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等外，均能利用枸橼酸盐。,(四)、抗原构造 沙门氏菌属的抗原构造极为复杂一般分为：“O”抗原(菌体抗原，化学成分为蛋白质、多糖、脂类等，按O抗原不同分为42个群)、“H”抗原(鞭毛抗原，化学成分为蛋白质)和“VI”抗原(表面抗原又称荚膜或包膜抗原，化学成分为糖脂)。此外，还有部分沙门氏菌具有M抗原(粘液抗原)。后两者不常用于分类。,(五)、抵抗力沙门氏菌在水中可存活23周，在粪便中可存活12个月，冰冻条件下可保持12个月。抗热力较弱，601020分钟即可杀死。煮沸后迅速死亡。对消毒剂，如5石炭酸或1500升汞水5分钟可杀死。对磺胺类药物、青霉素、链霉素抵抗力较强对氯霉素、合霉素极敏感。胆盐、煌绿及其他染料对本属细菌的抑制作用较其他肠杆菌小。故可用来制备选择培养基，供分离肠道中的沙门氏菌用。,二、食物中毒,世界各地的食物中毒中，沙门氏菌性食物中毒常占首先或第二位。()、中毒机制沙门氏菌性食物中毒般认为进食大量活菌（105109）和毒素的协同作用所造成。潜伏期很短，活菌进入肠道后在其中繁殖，继而侵袭肠粘膜及肠粘膜下层，引起发炎，水肿，充血和出血，可造成菌血症和释放内毒素。部分含抗原的细菌还能在吞噬细胞内繁殖，据认为抗原能防止细菌在细胞内的破坏。毒素包括内毒素和肠毒素。内毒素可引起发烧并使消化道蠕动增加而发生呕吐和腹泻。由于蠕动加快，肠道内致病菌被迅速排出体外，故患者在短期内多可恢复。肠毒素能使细胞膜的腺苷酸环化酶活力增高，使细胞的氯离子分泌亢进和对离子吸收的抑制，从而引起起小肠过度分泌水分和电解质，产生腹泻，认为肠毒素是导致腹泻的因素。,(二)、中毒表现沙门氏菌除甲、乙、丙型伤寒杆菌仅对人类致病外，多种菌是动物和人类的共同致病菌；也有的对动物是致病菌，对人类是条件致病菌。由感染沙门氏菌引起的疾病统称沙门氏菌病。在人类主要为伤寒、副伤寒、食物中毒及败血症等。潜伏期平均412小时，最短2小时，长者达25日。起病急，体温可升高至3840左右，伴呕吐、腹痛、腹泻（多为水样便）等症状。病情轻重程度不一，有时可出现伤寒或霍乱样症状。般病程短，预后较好，但严重者也可引起死亡。,三、微生物学检验（GB/T4789.4）,（一）、增菌培养,冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品首先需要进行前增菌。1、取样25g(m1)，加入225ml缓冲蛋白胨水中。固体食品可先用均质器以800010000转分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使其乳化。2、36+1培养4小时，移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液（MM）或四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）内，于42C培养1824小时。同时，另取10ml，加入于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）内，于36+1培养1824小时。鲜肉，鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌，各取25g(m1)加入灭菌生理盐水25ml按上述方法做成匀浆，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养1824小时；另一半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1培养1824小时。,（二）、分离培养,用铂金耳取一环增菌液分别划线接种于：亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、SS琼脂平板)各一个，于36+1分别培养1824小时(DHL、HE、SS)或4048小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌属亚属工、V和型在各个平板上的菌落特征见表5-1,（三）、生化试验,挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表52。表52说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。,接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1培养1824小时，必要时可延长至48小时，按表5-3判定结果。沙门氏菌的结果应属于A1、A2和B1，其他五种反应结果均可以排除。反应序号A1，典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-4仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。,（四）、血清学分型鉴定,用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。1、抗原的准备2、O抗原的鉴定 用AF多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株；不能分型。3、H抗原的鉴定 4、Vi抗原的鉴定,（五）、菌型的判定和结果报告,综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型，并报告结果。若结果为阴性，则报告为“未发现沙门氏菌”。目前，对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认，其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱即可应用于沙门氏菌的快速检验。我国在这方面也取得一定的进展，如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法，酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点，还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段，有待于我们去研究探讨，以便更好服务于实践。,第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验,致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)4、出血性大肠埃希氏菌(EHEC)5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC),致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热(ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌中毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。,一、生物学特性,1形态与染色特性 菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、13um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。,2培养特性,1)需氧及兼性厌氧菌2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15-45范围内均可生长，但最适生长温度为37，最适pH为7.27.4。3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。,4)在肉汤培养基中生长1824小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。5）部分菌落可出现溶血。6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落7）在SS琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色,3生化特性,1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。3）本菌可使赖氨酸脱胺、不能使苯丙氨酸脱羧。4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，5）不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌。,4.血清学特性,大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。,2）H抗原 为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。3）K抗原 是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。，,O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。,5抵抗力,抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到02mgL时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。,6毒素特性,有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。（2）、耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。,二、致病性,致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状：1肠道内感染 1）、肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。2）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。3）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。2肠道外感染 肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。,三、主要症状,致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为1224小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39)、头痛、腹痛等，病程一般为13天。,四、流行病学特点,1、发病季节 多发生在夏秋季2、引起中毒的食品种类 与沙门氏菌相同。3、食品种大肠埃希氏菌的来源 由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为28，高者达44，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达2952。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。,五、检 验 致病性大肠埃希氏菌的检验应按中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法(微生物学部分)(GB47896-2003)的有关内容进行检验。其检验程见教材。（一）、增菌培养 1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于361培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42增菌培养18小时。（二）、分离培养 1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。2、于361培养1824小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。,（三）、生化试验 1、初筛试验 选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中经36C培养1824小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。2、复筛试验 把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。3、证实试验 致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+一，乳糖产酸+90，柠檬酸盐，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或，阿拉伯糖十，靛基质十95：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。,（四）血清学试验 1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验 假定试验：从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。证实试验：2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验 在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：,（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 1、动物试验 将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1培养24小时，3000转分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热6030分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。1）家免结轧回肠段试验：取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按1015cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。,测定LT时，于注射后18小时剖腹检查测定ST时，于注射后68小时剖腹检查取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于1者为阳性。2）乳鼠灌胃试验检测ST：,2、双向琼脂扩散试验检测LT 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，361培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1经56时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1经1520小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。,（六）豚鼠角膜试验 供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株1820小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。体重400-500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分泌物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。,（七）、结果报告 根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。,志贺氏菌属即通称的痢疾杆菌，为一类能使人和猿产生痢疾疾病的革兰氏阴性杆菌。通常志贺氏杆菌(Bacillus，shigae)仅指I型痢疾志贺氏菌。志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离得到的，因此而得名。,第四节 志贺氏菌及其检验,志贺氏菌属有四个血清组，即A。B、C、D。(1)A群:又称痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae),通称志贺氏痢疾杆菌。不发酵甘露醇。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。（2）B群：又称福氏志贺氏菌（Sh.flexneri），通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型（含亚型及变种），抗原构造复杂，有群抗原和型抗原。根据型抗原的不同，分为6型，又根据群抗原的不同将型分为亚型；X、Y变种没有特异性抗原，仅有不同的群抗原。（3）C群：又称鲍氏志贺氏菌（Sh.boydii），通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。（4）D群：又称宋内氏志贺氏菌（Sh.sonnei），通称宋内氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，并迟缓发酵乳糖，一般需要34天。只有一个血清型。有两个变异相，即相和相；相为S型，相为R型。,一、生物学特性,1形态与染色特性 本属细菌为两侧平行、末端钝圆的短杆菌，23umX0.50.7um与其他肠道杆菌相似。无荚膜，无鞭毛，不形成芽孢，革兰氏阴性，个别菌带有菌毛。,2培养特性,1)需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。2)对营养要求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。3)在10一40范围内可生长。最适温度为37左右。最适pH值为72。4）在固体培养基上，培养1824小时后形成圆形、隆起、透明，直径23mm、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落。,3生化特性,注：阳性；阴性；/多数阴性，少数阳性；（）迟缓阳性；d有不同生化型。福氏志贺氏6型生化特性与A群和C群相似。,4血清学特性,志贺氏菌四个亚群各具有不同的抗原构造，都是由菌体抗原(O)及表面抗原(K)所组成。B亚群细菌的抗原关系比较复杂，根据各血清型的群抗原和型抗原构成的不同，尚可再分为亚型，如1型可分为1a亚型和1b亚型等。B亚群有6个血清型，连同亚型X、Y两个变种共13种不同的抗原构造。,5抵抗力,抵抗力较弱，在一般情况下。本属细菌在染菌的衣物中，室温暗处可存活546日在泥土中，于室温暗处可存活912日，自然污染的粪便，如使之保持碱性并湿润，可在其中存活很多天，但如有大肠杆菌或其它产酸菌活动时，数小时便可死亡，在水里可存活数月，在2的冰块中可存活53日，其中宋内氏志贺氏菌比福氏志贺氏菌2a型存活数多。在猪肉、米、面等食品中，志贺氏菌的增殖率随温度上升而增加，在37C比在10的增殖数量约高一万倍。志贺氏菌经55加热1小时、或05石炭酸作用6小时或1石炭酸作用1530分钟即可杀死。,6毒素特性 志贺氏菌既可产生内毒素和外毒素。内毒素是一种耐热性肠毒素，其化学成分为脂多糖和蛋白质复合物，并与菌体的O抗原相当。在实验动物(小自鼠、大白鼠)体内，可引起腹泻，白细胞减少，发热、肝糖原下降等。外毒素也叫神经毒素，是不耐热的蛋白质，经80加热1小时即被破坏。仅痢疾志贺氏菌和部分舒密次杆菌产生此种毒素。以家兔最为敏感，人的中毒剂量为 000006mg，外毒素主要作用于小血管，使小白鼠和家兔出现神经症状，使大白鼠和家兔出现肠道水肿和出血，使地鼠出现肺水肿和胸腔出血，而一般豚鼠对其具有抵抗力。,二、致病性 志贺氏杆菌是侵入性细菌，只需千个、百个、甚至几个就可能引起疾病发生，与大肠埃希氏菌不同。后者需要食入大量细菌才会引起中毒。菌体进入体内后侵入空肠粘膜上皮细胞繁殖，产生外毒素，菌体破坏后产生内毒素作用于肠壁、肠壁粘膜和肠壁植物性神经。三、主要症状潜伏期一般为1020h，短者6h，病人会出现剧烈的腹痛、呕吐及频繁的腹泻，并伴有水样便，便中混有血液，发热，体温高者可达40度以上，有的病人出现痉挛。,四、流行病学1、季节性特点 多发生于710月。2、食品的种类主要是凉拌菜。3、食品被污染和中毒发生的原因本菌携带者或食品加工、集体食堂、饮食行业的从业人员患有痢疾时，手时污染食品的主要因素。熟食品被污染后，存放在较高的温度下，志贺氏菌大量繁殖，食后引起中毒。,五、检 验志贺氏菌检验程序(GB47895-2003)如教材P113。,1、临床特点符合志贺氏菌食物中毒流行病学特点，病人有类似痢疾样症状，粪便中有血液等。2、采样按照采样原则对食品进行采集。如果有食物中毒，可从剩余食物、病人吐泻物分离志贺氏菌。3、增菌 称取样品25g加入到装有225ml GN增菌液的500mL三角瓶中，如果是固体食品应用均质器以800010000转分打碎1分钟，或用研钵加灭菌砂磨碎。粉状食品用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。在36+1的条件下培养68小时。,4、分离培养 用接种环挑取增菌液1环，划线接种于HE平板或SS琼脂平伴一个，麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板一个，于361培养1824小时。志贺氏菌在这些培养基上出现无色透明不发酵乳糖的菌落。5、生化试验 挑取平板上的可疑菌落；接种三糖铁和半固体培养基各1管。志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层产酸、不产气，斜面声碱，不产H2S。无动力，固体管内沿穿刺线生长。4、血清学试验 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查。,5、快速诊断法1荧光菌球法：适于检查急性菌痢的粪便标本。将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中，37培养48小时。如标本中有相应型别的痢疾杆菌，繁殖后与荧光素抗体凝集成小菌球，在低倍或高倍荧光显微镜下易于检出。方法简便、快速，有一定的特异性。2协同凝集试验：用志贺氏菌的lgG抗体与富含A蛋白的葡萄球菌结合，以此为试剂，测定患者粪便滤液中志贺氏菌的可溶性抗原。,第五节 葡萄球菌及其检验,葡萄球菌在自然界中广泛存在于空气、土壤、水及物品上，特别是人和家畜的体表及外界相通的腔道检出率都相当高。可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。葡萄球菌常引起人及动物组织器官脓肿、创伤化脓及败血症、食物中毒。其食物中毒主要是金黄色葡萄球菌引起，是由该菌产生的肠毒素引起的，通常是通过患病的动物产品以及患化脓创的食品加工人员及环境因素引起食品污染，如果条件适宜，就有毒素产生，12小时能产生足以引起中毒的量。这些污染食物被人食用后，则会引起食物中毒。,一、生物学特性,1形态与染色特性 革兰氏阳性菌，为圆球形，直径为041。2um，大小不一，无鞭毛、无芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色。致病性的葡萄球菌较非致寄性的葡萄球菌菌体小，在固体培养基上繁殖时堆积成葡萄串状。但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，染色特性发生逆转，革兰氏染色为革兰氏阴性。,2培养特性 1）为需氧或兼性厌氧菌，在含有二氧化碳2030的环境中有利于毒素的产生。2）营养要求不高，在普遍培养基上生长良好。培养1824小时后，可形成圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润有光泽、不透明的中等大菌落；葡萄球菌在固体培养基上生长，不同的菌株产生不同的颜色，据颜色不同而将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌。该菌产生的色素为脂溶性的。在含有血液、血清或葡萄糖的培养基上生长更好。本菌生长的最适温度为37最适pH为7.4。,4）该菌耐盐性强，在含10一15氯化钠培养基中亦能生长，故可用高盐培养基分离全黄色葡萄球菌。5）鲜血琼脂平板形成较大的菌落；多数菌株能产生溶血素而使菌落周围出现溶血环。非致病菌则无此现象。6）Baird-parker氏琼脂 圆形、光滑、凸起、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带并在其外层有一透明带。,3生化特性葡萄球菌的生化反应不规则，大多数菌株能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖产酸不产气。金黄色葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇产酸，非致病性菌则无此现象。根据葡萄球菌的生化特性不同及产生的毒素及细胞结构的差异，可将该菌分为三种，即金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌。,4抗原特性 葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成份：即蛋白质抗原和多糖类抗原；1）、蛋白质抗原(1)、为细胞壁表面上的一种蛋白质，称为葡萄球菌A蛋白(Staphylococcald protein A,SPA)，位于菌体表面，与胞壁的粘肽相结合。(2)、完全抗原，具有种属特异性，无型特异性。(3)、所有来自人的菌株均含有SPA，而来自动物的菌株则少见。(4)、SPA可与IgG的Fc片段结合。它与人及多种哺乳动物血清中的lgG的 Fc 段结合，因而可用含SPA的葡萄球菌作为载体，结合特异性抗体，进行协同凝集试验，可作快速的诊断方法。,2）、多糖抗原(1)、半抗原；(2)、具有型特异性，可用此抗原将葡萄球菌分为三个型(A、B、C型)。金黄色葡萄球菌目前主要采用噬菌体进行分型，共分成5个群(组)23(23)个型。金黄色葡萄球菌除具有以上特性外，其在生长繁殖过程中还产生很多毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。,5抵抗力 在无芽胞的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。在干燥的脓汁中可生存数月，湿热8030分钟才能将其杀死。5石炭酸，01升汞中1015分钟死亡。耐盐性强。如培养基中加入龙胆紫液可抑制其生长。在冷藏环境中不易死亡。临床上用1-3%龙胆紫治疗有本菌引起的化脓，效果很好。对磺胺类药物敏感性较低。对红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。肠毒素的耐热性强。带有毒素的食物煮沸120分钟方能破坏其毒素。低温下2个月以上方失去毒力。,二、致病性 金黄色葡萄球菌致病的特点是化脓性炎症，产生肠毒素的菌株能引起食物中毒：金黄色葡萄球菌的致病物质主要有毒素和酶。1、溶血毒素（Staphyolysin）：外毒素，可使动物红细胞溶解，培养时出现溶血环。按抗原性不同，至少有、五种，对人类在致病作用的主要是溶血素。它是一种“攻击因子”，化学成分为蛋白质，6530分钟即可破坏。如将-溶血素注入动物皮内，能引起皮肤坏死，如静脉注射，则导致动物迅速死亡。溶血素还能使小血管收缩，导致局部