金黄色葡萄球菌检验与计数.ppt
金黄色葡萄球菌检验与计数,严纪文,概况,葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。,金黄色葡萄球菌的生物学特性,形态与染色：金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，直径0.41.2m，大小不一，平均直径约为0.8m。革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。,培养特性：易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。需氧或兼性厌氧。最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。在普通营养琼脂平板上培养1824，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。,在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。,金黄色葡萄球菌的酶,金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活性。耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。该酶的最适pH为9.0。,金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水，难溶于有机溶剂。,金黄色葡萄球菌的肠毒素,耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一般烹调温度不能将其破坏。218248 的油中需30min才能被破坏。可引起急性胃肠炎。根据肠毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E 5 个型。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。,A型肠毒素毒力较强，摄入1g即可引起中毒；B型毒力较弱摄入25g，才引起中毒。一般认为引起人中毒的最小剂量是1.07.2g/kg。,主要修订内容,将原标准拆分为两个分标准(检验和计数)。增加计数标准的方法：MPN法、PetrifilmTM纸片法。对有些描述更细化。增加计数公式。,金黄色葡萄球菌检验,金黄色葡萄球菌的检测程序,检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液,7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,361,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报告,血平板1824h，Baird-Parker平板1824h或4548h。,BHI肉汤和营养琼脂小斜面,361,1824h,增菌培养基,7.5%氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。胰酪胨大豆肉汤：含氯化钠达10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促进葡萄球菌的生长。,样品的稀释,固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。,增菌与分离培养,增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL 7.5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培养18h24h。Baird-Parker平板361培养18h24h或45h48h。,分离培养基,Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。,长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,分离培养基,血琼脂：是一种基础培养基，含有5%的脱纤维血(羊血或兔血)。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈溶血。金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。,金黄色葡萄球菌的重要鉴定-血浆凝固酶试验,试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。,血浆凝固酶试验,挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，361培养18 h24 h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。,同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。,结果报告,如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。,影响血浆凝固酶试验的因素,血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。用人血浆出现凝固的时间短，约93.6%的阳性菌在1h内出现凝固。用兔血浆1h内出现凝固的阳性菌株仅达86%，大部分菌株可在6h内出现凝固。若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。,不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落做血浆凝固酶的实验，因所有高盐培养基都可以抑制A蛋白的产生，造成假阴性结果。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。实验必需设阳性(标准金黄色葡萄球菌)、阴性(白色葡萄球菌)、空白(肉汤)对照。玻片法只能检测结合凝固酶，而试管法可检测两种凝固酶。因此，两种试验所得结果可完全不同。玻片法只用于筛选。,金黄色葡萄球菌计数,第一法 Baird Parker 平板法第二法MPN法第三法PetrifilmTM测试片法,第一法:平板计数法,主要修改内容,统一了样品的处理程序；增加了计数范围要求：选择20200cfu菌数的平板；增加了计算公式 两个(修改了ISO的计算公式)；规定了方法的适用范围：适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品。,检验程序,检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液,10倍稀释,选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板,计数及血浆酶试验,报告,361,4548h,样品的接种、培养与典型菌落的确认,根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml，以0.3，0.3，0.4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。培养温度与时间：361，4548h。典型菌落确认：从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养1824h后进行血浆凝固酶试验。,典型菌落计数与计算公式的应用,计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。,公式一的使用范围：-最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落；-某一稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；-某(低)一稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20 cfu200 cfu之间，计数该(高)稀释度平板上的典型菌落；,公式一,T=AB/Cd T:样品中金黄色葡萄球菌落数；A:某一稀释度典型菌落的总数；B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d:某一稀释度。,公式应用例一,公式一：T=AB/Cd T=65450.1=520,高、低稀释度平板均有典型菌落，但其中高稀释度二平板的菌落数均不在20200之间，选择低稀释度的平板进行计数。,公式二的使用范围：平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间。N=T/1.1d T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；d：稀释因子(第一稀释度)。公式引用于ISO 6888-1:1999(E),公式二,公式应用例二,公式二：N=T/1.1d T1=18335=110 T2=2145=17 T=T1+T2=110+17=127 N=T/1.1d=1271.10.1=1200,所有稀释度平板合计菌落数均在20200间：,结果报告,单位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N为0，报告1d-1 cfu/mL(g)。,第二法 MPN法,MPN检验程序,25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质,10倍系列稀释,选择3个适宜稀释度的样品匀液，吸1mL样液，每稀释度各接种3管胰酪胨大豆肉汤，样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点,361,4548h,接种Baird-Parker平板,血浆凝固酶试验,4548h,361,查MPN表,报告结果,接种和培养,根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml接种到胰酪大豆肉汤管，每稀释度接种3管。361培养4548h。用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环分别接种于Baird-Parker平板361培养4548h。确认典型菌落，并从典型菌落中至少挑取1个菌落做血浆凝固酶试验。,结果报告,计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表。结果报告：MPN/g或MPN/mL,注意要点,MPN法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。“样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点”的理解：-尽可能避免1100MPN/g或ml的出现。-方便MPN表的查找。,第三法PetrifilmTM测试片法,适用范围,PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。,PetrifilmTM测试片法检验程序,检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释,选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片,361,242h,判读,没有菌落,只有典型紫红色菌落,将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌,除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落,加入确认反应片，361，培养13h,有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌,报告,第三法 PetrifilmTM测试片法,金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以直接完成鉴定和计数。,金黄色葡萄球菌PetrifilmTM确认反应片,金黄色葡萄球菌PetrifilmTM确认反应片含有显色剂和耐热去氧核糖核酸(DNA)，金黄色葡萄球菌可生产耐热DNA酶，此酶与反应片上的显色剂反应，形成粉红色环。而其他细菌因不产生耐热DNA酶没有该反应。但在葡萄球菌属中，猪葡萄球菌、中间葡萄球菌也会产生阳性反应。,计数与结果报告,菌落计数:到培养时间应立即计数，可目视、或用放大镜辅助计数；选取菌落数在15150之间的测试片作为计数标准。选择菌落数在15150之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之；,如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以()1乘以最低稀释倍数报告之；如果最高稀释度的菌落数大于150个时，计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之，计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以30即为测试片上估算的金黄色葡萄球菌数(圆形生长面积为30 cm2)。最终菌落浓度的单位以”cfu/g(mL)”表示。,谢谢!,
