酶工程10有机溶剂中的酶催化作用.ppt

第十章 有机溶剂中的酶催化作用,长期的观点认为:有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫无进展。,这一观点直到1984年，非水溶剂中酶催化的研究才取得了突破性的进展。,1984年美国Klibanov,A.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述。,Klibanov等的工作在仅含微量水的有机介质(Microaqueous media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。,基于研究工作，libanov等提出只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。,这一观点无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想的挑战,酶在非水介质中的催化反应具有在许多常规水溶液中所没有的新特征和优势：可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化，大大拓展了酶催化 作用的底物和生成产物的范围；改变了催化反应的平衡点，使在水溶液中不能或很难发生的反应 向期望的方向得以顺利进行，如在水溶液中催化水解反应的酶在 非水介质中可有效催化合成反应的进行；使酶对包括区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性大为提 高，使对酶催化作用的选择性的有目的的调控的实现成为可能；大大提高了一些酶的热稳定性；由于酶不溶于大多数的有机溶剂，使催化后酶易于回收和重复利 用；可有效减少或防止由水引起的副反应的产生；可避免杂水溶液中进行长期反应时微生物引起的污染；可方便地利用对水分敏感的底物进行相关的反应；当使用挥发性溶剂作为介质时，可使反应后的分离过程能耗降低,从上世纪八十年代中期开始，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。,现已报导，酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶等氧化还原酶类和醛缩酶等转移酶类中的十几种酶在适宜的有机溶剂中具有与水溶液中可比的催化活性。,用于酶催化的非水介质包括：(1)含微量水的有机溶剂；(2)与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系；(3)水与有机溶剂形成的两相或多相体系；(4)胶束与反胶束体系；(5)超临界流体；(6)气 相。,非水酶学的研究主要集中在三个方面：一、非水酶学基本理论的研究，它包括影响非水介质中酶催化的主要因素以及非水介质中酶学性质。二、通过对酶在非水介质中结构与功能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制，建立和完善非水酶学的基本理论；三、利用上述理论来指导非水介质中酶催化反应的应用。,非水介质反应体系 通常，酶催化反应体系包括了水溶液反应体系、有机介质反应体系、气相介质反应体系、超临界流体介质反应体系等多种，在这些反应体系中，除水溶液反应体系外，其他的反应体系统称为非水介质反应体系。在众多非水介质反应体系中，以有机介质反应体系的研究最多，应用也最广泛。常见的有机介质反应体系主要包括了微水有机介质体系、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系、胶束体系和反胶束体系等。,1 微水有机介质体系 微水有机介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，也是有机介质酶催化中应用最为广泛的一种反应体系。,酶分子的结合水对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。一般酶都是以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质之中，在悬浮状态下进行催化反应。,2 与水溶性有机溶剂组成的均一体系 由水和极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系，体系中水和有机溶剂的含量均较大。,酶和底物是以溶解状态存在于体系之中，由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在这类反应体系中进行催化反应的酶较少。,3 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。,游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，而疏水性底物或产物则溶解于有机溶剂相中。,一般这种体系仅适用于底物和产物或其中的一种是疏水化合物的酶催化反应。其中，最常用的是两相体系。,4 胶束和反胶束体系 当水和有机溶剂同时存在于反应体系时，加入表面活性剂后，两性的表面活性剂会形成球状或椭球状的胶束，其大小与蛋白质分子在同一数量级上。,当体系中水浓度高于有机溶剂时，形成胶束的表面活性剂的极性端朝向胶束的外侧，而非极性端则朝向胶束的中心，有机溶剂就被包在胶束的内部，此时的胶束就称为正相胶束或简称为胶束；当体系中水浓度低于有机溶剂时，形成胶束的表面活性剂的极性端朝向胶束的中，而非极性端则朝向胶束的外侧，水就被包在胶束的内部，此时的胶束就称为反相胶束或简称为反胶束。,一般而言，在不同的非水介质中进行酶催化时所表现出的催化行为是有区别的,不同反应体系中酶的一些催化行为比较,二 酶在非水介质中的性质酶能在非水介质中发挥催化作用的主要原因是酶在有机介质中能够保持完整的结构和活性中心的空间构象，然而，酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而影响酶的热稳定性、底物特异性、立体选择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质，进而显示出与水溶液中不同的催化特性。,1 热稳定性,许多酶在非水介质中的热稳定性和储存稳定性比相同酶在水溶液中更好，而且这种热稳定性和储存稳定性的提高是难以用化学交联、固定化甚至是蛋白质工程的手段所能达到的，且这种稳定性还与介质中的水含量有关。,例如，猪胰脂肪酶在有机溶剂中100 时的半衰期可达数小时，而在水中100几乎马上失活。1%的水浓度会使猪胰脂肪酶的稳定性降低到与水溶液中相同的水平。又如，胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中20放置6个月后酶活力没有降低，而在同样温度下酶在水溶液中的半衰期仅有几天。,表9.2一些酶在有机介质和水溶液中的热稳定性比较,2 底物专一性,同水溶液中的酶催化一样，酶在非水介质中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。,值得指出的是，不同的有机溶剂具有不同的极性，因此，在不同的有机溶剂中酶的底物专一性也是不同的，有机溶剂改变时，酶的底物专一性也会发生改变。一般来说，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易进行反应，而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易进行反应。,3 对映体选择性,酶的对映体选择性是指酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力，这种选择性是由不同对映体与酶的活性中心的三维空间构像的互补性或称亲和力决定的。非水介质中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。,酶的立体选择性与反应介质之间存在着一定的关系，一般来说，酶在水溶液中的对映体选择性较强，而在疏水性较强的有机溶剂中，酶的对映体选择性较差。,4 区域选择性,区域选择性，即酶能够选择性地优先催化底物分子中某一区域的基团进行反应。酶在非水介质中进行催化时，区域选择性可能会发生一定变化。,5 化学键选择性,酶催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。化学键选择性是指当同一个底物分子中有2个以上的化学键都可以与进行反应时，酶对其中的一个别化学键可以优先进行催化反应。在有机介质中进行酶催化反应时，化学键选择性可能变化。,6 pH记忆 在有机介质酶催化反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体之前所使用的缓冲液pH值相同，而酶的催化反应速度与其冻干或吸附到载体之前缓冲溶液的pH密切相关，非水介质中的酶能够“记忆”冻干或吸附到载体之前所处缓冲液中的pH值，反应的最适pH接近于水溶液中的最适pH。,三、非水介质反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响,1 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响是非水酶学所要阐明的一个重要因素，溶剂不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性（包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。通常有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的这些性质。,一些亲水性相对较强的极性有机溶剂，特别是与水互溶的有机溶剂却能够夺取酶蛋白表面的“必需水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶的失活。,2 有机溶剂对酶结构的影响 在含微量水有机介质中时，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，蛋白质分子内氢键起主导作用，导致蛋白质结构变得更为“刚硬”，活动的自由度变小，限制了疏水环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态转化，从而能维持着和水溶液中同样的结构与构象。,3 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用，影响酶的活力。有机溶剂能改变酶分子“必需水”层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入“必需水”层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。有机溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物的溶剂化上，这种溶剂化作用会直接影响到反应的动力学和热力学平衡。,应该说，有机溶剂对酶催化反应的影响是一个综合而复杂的过程，其中包括溶剂对水-酶相互作用的扰动和扭曲、与固定化酶微环境之间的匹配以及对底物和产物的溶剂与扩散等因素。,4 有机溶剂对酶选择性的影响 应该说有机溶剂对酶选择性的影响是非常大的，由于有机溶剂的存在是酶蛋白分子的刚性得以增强，使之具有水溶液中所不可比拟的优越性：良好的对映体选择性或区域选择性。,目前的模型都是在针对特定的酶、底物和体系的研究过程中建立起来的，尚不足以总结出普遍适用的规律。,四、水对非水介质中酶催化的影响 现有的研究成果已经证明，酶只有在一定量水的存在下，才能进行催化反应，无论是在水溶液或是在有机介质中进行酶的催化反应，水都是不可缺少的条件之一。特别是在有机介质中的酶催化反应，水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度等都有密切关系。,1 必需水 已经知道，酶分子只有在空间构象完整的状态下才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。,在有机介质中，酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象。一般将维持酶分子完整空间构象所必需的最低水含量称为必需水。必需水是酶在非水介质中进行催化反应所必需的，它会直接影响酶的催化活性和选择性，通过必需水的调控，可以调节有机介质中酶催化反应中酶的催化活性和选择性。,由于必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等所必需的，而氢键、盐键等又是酶空间结构的主要稳定因素，酶分子一旦失去必需水，就必将使其空间构象破坏而失去催化功能。,有机介质反应体系中含有的水主要有两类:一类是与酶分子紧密结合的结合水;另一类是溶解于有机溶剂的游离水，可以认为，在有机介质反应体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素。,可以通过用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶 液和酶制剂；向反应体系中直接加一种水合盐；向每一溶剂中加入不同量的水等三种方 式来获得恒定的水活度 等方式来控制反应体系的水活度。,2 水对酶催化反应速度的影响 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。多年来的研究使人们在非水介质酶催化反应中存在了一个共识，即微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水间接或直接地参与了酶天然构象中包括氢键、静电作用、疏水相互作用和范德华力在内的所有非共价相互作用。,一般认为酶蛋白分子的水化过程可以分为四个步骤：酶蛋白分子的离子化基团水化过程，在此过 程中，水与酶蛋白分子表面的带电基团结合；酶蛋白分子中的极性部分水簇的生长过程，即 水与酶蛋白分子表面极性基团结合；水吸附到酶蛋白分子表面相互作用较弱的部 位；酶蛋白分子表面完全水化，被单层水分子所覆 盖。,大量研究表明，非水介质中酶的活性比水溶液中要低好几个数量级,酶在有机溶剂中活力低的原因,4 水对酶活性的影响 在低水含量的非水介质酶催化反应体系中，水分的影响是至关重要的，要使酶能够表现出最大的催化活力，确定适宜的体系水活度就显得十分重要。不同种类的酶因为其分子结构的不同，维持酶具有活性的构象所必需的水量也就不同，即使是同一种类的酶，由于酶的源不同，所需的水量也会有显著不同。,酶在非水介质中的存在形式在有机溶剂中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在状态有多种形式，主要分为两大类：一、固态酶，二、可溶解酶。,固态酶它包括冻干的酶粉或固定化酶、结晶酶以固体形式存在有机溶剂中,可溶解酶主要包括：水溶性大分子共价修饰酶非共价修饰的高分子酶复合物表面活性剂酶复合物微乳液中的酶等,五、非水介质中的酶催化反应类型 酶用于有机合成的范围在不断扩大，在机相中酶催化可完成的反应有：氧化、还原、脱氧、脱氨、羟化、甲基化、酰胺化、磷酸化、异构化、环氧化、开环、卤化等。,C-O键的形成（1）酯类：酯酶和脂肪酶可催化 酯合成反应、转酯反应和酸 酐水解反应。（2）环氧化合物（3）糖苷键的水解和形成（4）加氧氧化反应,酯合成反应,转酯反应,酸酐水解,环氧化合反应,糖的焦磷酸化，糖的异构化,糖的衍生物,醇解,加氧氧化反应,2.C-N键的反应肽的合成,3.C-C键的形成（1）羟醛反应（2）酮醛和羟醛转移反应（3）醛缩合反应（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应（5）醛加成反应,（1）羟醛反应,（2）酮醛和羟醛转移反应,（3）醛缩合反应,（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应,（5）醛加成反应,4.还原反应,5.氧化反应（1）C-H,C=C 氧化（2）醇氧化（3）苯酚氧化（4）羧酸氧化（5）C-N氧化,（）C-H,C=C 氧化,（）醇氧化,（3）苯酚氧化,（）羧酸氧化,（5）C-N氧化,6.异构化反应,7.C-X的反应卤化反应：,六、非水介质酶催化的应用,近年来的大量研究已经表明，在非水介质中酶常常会有高度的选择性，包括立体选择性、对映体选择性、区域选择性和化学选择性，这为非水介质酶催化在有机合成领域中的应用开辟了极有意义的新天地。,迄今为止，已有以脂肪酶、蛋白酶为典型代表的多种酶被用于非水介质中催化酯化、酯交换、肽合成和大环内酯合成等多种反应，其中特别在前手性化合物的不对称合成、对映体的选择性拆分等方面获得了有重要意义的应用。,1 光学活性化合物的制备A 可以将有潜在手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的光学活性；B 可以非水介质中的酶催化反应合成含磷、硫、氮及金属的光学活性化合物；C 可以利用非水介质中的酶催化进行外消旋化合物的拆分反应。,普萘洛尔的酶法拆分 利用PSL（假单胞菌脂肪酶）在有机溶剂中可对外消旋的萘氧氯丙醇酯进行水解，得到了(R)酯的ee值大于95%；而利用PSL对消旋的萘氧氯丙醇进行选择性酰化，也得到了ee大于95%的光学活性的()醇。,环氧丙醇的酶法拆分 PPL（猪胰脂肪酶）在有机溶剂中与两相体系中可对,环氧丙醇的丁酸酯进行了酶促拆分。,布洛芬的酶法拆分 在有机溶剂中对布洛芬进行酶促酯化反应时加入少量的极性溶剂，可使酶的选择性有明显的提高，如加入了二甲基甲酰胺后，最后得到(S)-布洛芬的ee值从57.5%增加到了91%。,羟色胺拮抗物和摄取抑制剂类手性药物 羟色胺（5-HT）是一种涉及到各种精神病、神经系统紊乱，如焦虑、精神分裂症和抑郁症的一种重要神经递质。制备过程中，成功地将非水介质中实现了酶法拆分。,其它手性药物 利用脂肪酶对合成昆虫信息素、-维生素E、3及前列腺素类似物的重要中间体叔苯氧酸酯进行酶促拆分反应,得到了二种不同的异构体。,2 旋光性聚合物的合成 利用水解酶在非水介质中可以合成多种手性聚合物。这些手性聚合物具有广阔的应用前景。,非水介质中酶催化的一些应用,